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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 Primary adipocyte 세포 배양액에서 TG/FFA 측정
구분 체지방감소 링크 지방분해 증가
실험배경
비만은 에너지 섭취가 소비보다 많아 과잉된 칼로리가 지방조직에 축적되어 대사성 불균형이 장기간 지속되는 대사성 질환으로 고지혈증, 고혈압, 담석증, 당뇨병 등 각종 성인병을 야기시키는 위험인자로 작용한다. 고열량 고지방 식이 (high calorie high fat diet)는 총열량의 60%를 지방으로 공급하는 식이로서 랫드에 장기간 공급 시 free fatty acid, triglyceride, cholesterol 같은 지질의 혈중 및 간에서의 함량, 비만관련 면역인자의 증가를 야기하여 비만을 유발시킨다.  본 실험에서는 고열량 고지방 식이를 이용하여 랫드에서 비만을 유도한 후 지방이 축적되어 비대해진 부고환지방에서 지방세포를 분리한다. 분리한 지방세포를 후보물질과 함께 배양한 후 후보물질의 지방분해 효과를 확인하고자 한다.
실험재료
필요장비 및 소모품
세포배양용 플레이트, 항온수조, 파스퇴르 파이펫, 원심분리기, 고열량 고지방 식이, 250 um 여과망
 
필요시약
Type-1 collagenase, Bovine Serum Albumin (BSA), Omental Adipocyte Maintenance Medium, TG assay kit, Free fatty acid assay kit
 
세포주
Primay adipocyte
 
실험방법
1. High calorie high fat diet(60% fat)로 비만을 유도한 수컷 SD rat을 경추탈골 시킨다.
2. 경추탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3. 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4. 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5. 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6. buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7. Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 uM filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8. 500~600 rpm으로 5 분간 centrifuge 한다.
9. 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한 방울 (10 ㎕)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10. 6 well plat에 5×104 cells/well로 seeding 한다.
11. 다음 날 세포배양액을 바꿔준 후 시료를 3일간 처리한다.
12. 세포배양액은 따로 모아 -40 ℃에 실험 전까지 보관하고, cell에서 folch법을 이용하여 지질을 추출한 후 -40 ℃에 실험 전까지 보관한다.
13. TG 또는 FFA assay kit을 이용하여 세포배양액과 cell에 있는 FFA를 측정하고, TG는 cell에서만 측정한다.
결과해석
후보물질에 의해 지방세포의 지방분해가 항진된 경우 세포내 축적된 TG량은 감소하고 FFA를 하나씩 떨어뜨려 glycerol로 FFA로 분해시켜서 세포밖으로 방출시킨다. Kit로 측정하였을 때 세포내 TG량은 감소, FFA량은 증가할수록 지방분해가 항진 된 것이다.
참고문헌 1. Watanabe T, Hata K, Hiwatashi K, Suppression of murine preadipocyte differentiation and reduction of visceral fat accumulation by a Petasites japonicus ethanol extract in mice fed a high-fat diet, Biosci. Biotechnol. Biochem., 74(3) p499-503, 2010
2. Zu Y, Li C, Fu Y, Zhao C., Simultaneous determination of catechin, rutin, quercetin kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leaves by RP-HPLC with DAD., J. Pharm. Biomed. Anal., 41(3) p714-719, 2009
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제목 Primary adipocyte 세포 배양액에서 TG/FFA 측정 링크 지방분해 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
 
 
필요시약
High fat high calories diet (60kcal % fat, Research Diet), 6 well plate, Water bath, 파스퇴르 파이펫, Centrifuge,
Hemocytometer, Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)
 
실험방법
1. 세포 배양
1) Male rat을 경추탈골 시킨다.
Tips:
- ether 마취시 지방에 축적되므로 절대 사용하지 말 것.
2) 경추탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 잘게 자른다.
Tips:
- 일반적으로 1~2 mm의 두께로 자름.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)를 넣고 37도씨에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
Tips:
- 지방이 buffer 위에 뜨기 때문에 꼭 shaking 해줘야 함.
6) Buffer 위 층에 지방 띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet을 이용하여 지방 띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 uM filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm 에서 5분간 원심 분리한다.
Tips:
- 상온에서 실시함. 상온에서 원심분리 해야 지방이 응고되는 것을 방지한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한방울 (10 ㎕)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후
Tips:
- 이때 cell이 터지기 쉽기 때문에 반드시 Yellow tip 끝을 잘라서 실험에 쓴다. 그것을 뒤집어 cell을 counting 한다.
Tips:
- hemotocytometer를 뒤집는 이유는 cell은 물보다 비중이 작기 때문에 counting하기가 어렵기 때문에 뒤집어서 counting해야 한다.
10) 6 well plat에 5×104 cells/well로 seeding 한다.
 
2. 준비
1) 실험 1시간 전부터 clean bench내의 UV 램프를 켜놓는다.
2) 실험에 쓰일 핀셋, 가위, 칼 등을 멸균하여 clean bench 내에서 다시 한번 화염 멸균시킨다.
3) 지방세포를 분리할 bottle, 250 uMfilter를 씌운 주사기 등을 멸균한다.
4) Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4; 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 0.5 mM Na2HPO4, 6 mM glucose, 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2) – 1 ㎎/㎖ collagenase, 2 mM glucose, 10 ㎎/㎖ bovine serum albumin)를 제조한다.
5) 본 실험은 가장 안정적인 37 ℃ 온도에서 행해져야 한다.
Tips;
- 만약에 추운 환경에서 하면 지방이 굳어서 분리되지 않는다.
 
3. TG, FFA 측정
1) 다음 날 세포배양액을 바꿔준 후 시료를 3일간 처리한다.
2) 세포배양액은 따로 모아 -40 ℃에 실험 전까지 보관하고, cell에서 다음의 folch법을 이용하여 지질을 추출한 후 -40 ℃에 실험 전까지 보관한다.
Tips:
- 지질 추출을 위한 Folch 법은 다음과 같다.
① chloroform/methanol 2:1 비율로 solvent를 제조한다
② tube에 1ml의 solvent를 넣고 sample을 넣는다.
③ adipocyte 경우 배지를 버리고 위에 뜬 지방도 되도록 제거 한 다음 cell만을 이용한다
④ Obital shaker에 넣고 RPM 200으로 15-20min shaking 시킨다.
⑤ 10000 rpm으로 10min으로 centrifuge한다
⑥ 새로운 tube에 세포층을 담기지 않도록 조심하면서 하층액을 담은 후, 하층액의 1/5 되는 양의 물을 넣어 주고 2초간 vortexing한 후 2000 rpm으로 10분간 다시 centrifuge한다.
⑦ 상층액은 버리고 유기 용매 층을 휘발시킨다.
3) TG 또는 FFA assay kit을 이용하여 세포배양액과 cell에 있는 FFA를 측정하고, TG는 cell에서만 측정한다.
실험결과 예

결과해석
1. Tea polyphenol 25, 50, 100 μM은 시료를 처리하지 않은 군에 비하여 adipocyte에서의 TG량이 각각 7.75, 12.15, 18.22 % 감소하였다.
2. Tea polyphenol 25, 50, 100 μM은 시료를 처리하지 않은 군에 비하여 adipocyte에서의 free fatty acid량이 각각 8.11, 74.90, 157.04 % 증가하였다. 따라서 세포내의 TG의 lipolysis가 시료처리에 따라 농도 의존적으로 증가되어 FFA로 방출된다는 것을 보여준다.
참고문헌 1. Rodbell M, Metabolism of isolated fat cells. 1. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis, J.Biol.Chem., 239(2) p375-380, 1964
2. Watanabe T, Hata K, Hiwatashi K, Suppression of murine preadipocyte differentiation and reduction of visceral fat accumulation by a Petasites japonicus ethanol extract in mice fed a high-fat diet, Biosci. Biotechnol. Biochem., 74(3) p499-503, 2010
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