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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 3T3-L1 fibroblast 세포배양 및 분화
구분 체지방감소 링크 기초실험법
실험배경
현재, 비만이나 대사성 질환 연구에 많이 이용되고 있는 세포주인 3T3-L1 fibroblast는 swiss mouse embryo에서 유래된 지방전구세포(preadipocyte)로 fibroblast의 일종이다. 3T3-L1 fibroblast는 fetal bovine serum(FBS)과 methylisobutylxanthine-dexamethasone-insulin(MDI)를 처리하면 세포내에 지방구가 축적되는 지방세포의 표현형을 획득할 수 있다. 지방세포의 분화에는 CCAAT-enhancer-binding proteins α(C/EBPα), peroxisome proliferator activated receptor γ(PPARγ) 전사인자가 관여하며, 이들은 GLUT4, fatty acid synthase, stearyl CoA desaturase, adiponectin 등과 같은 지방세포 특이 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 
그림 1. 3T3-L1 fibroblast 분화 단계 및 관련 유전자(Madsen L et al)
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Inverted microscope), 무균작업대(Clean bench), 항온수조(Water bath), 원심분리기, 액체질소탱크, Cryotube, 배양 플라스크(T25/T75), 세포배양기(CO2 incubator), 6 well plate, 1회용 pipette(10 ml), pipette, pipette tip, cell counter
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM), calf serum, fetal bovine serum, methylisobutylxanthine, dexamethasone, insulin, sodium pyruvate, tryphan blue, penicillin/streptomycin/glutamine, 0.5% trypsin-EDTA, phosphate buffered saline(PBS), Dimethyl sulfoxide (DMSO)
 
세포주
3T3-L1 fibroblast
 
실험방법
1. 지방전구세포 배양
1) 3T3-L1 fibroblast가 배양 플라스크 면적의 70~80% 정도 차지하면 계대배양을 한다.
2) 먼저, 배지를 제거하고 PBS로 washing 해준다.
3) Trypsin 처리하여 세포를 뗀 후, 배지를 첨가한다.
4) 세포를 tube에 모아 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가한다.
5) 세포현탁액을 배지와 적정 비율로 섞어 배양 플레이크에 넣고, 골고루 잘 퍼지도록 한다.
6) 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.

2. 지방세포 분화 유도
1) 적정수의 세포를 6 well plate에 분주한다
2) 세포가 꽉 찰때까지 기다렸다가, 세포가 꽉 차고 나서 2~3일 후에 insulin, methylisobutylxanthine, dexamethasone이 첨가된 10% FBS/DMEM 분화용배지로 교환하여 2일 더 배양한다(Day 0).
3) 10% FBS/DMEM에 insulin이 함유된 배지로 교환하여 2일 더 배양한다(Day 2).
4) 10% FBS/DMEM 배지로 교환하여 세포 내에 지방이 찬 것이 관찰될 때까지 배양한다(Day 4). 2~3일에 한번씩 배지를 갈아준다.
결과해석
3T3-L1 fibroblast 내에 지방구 축적이 관찰되면, 지방세포로 분화한 것으로 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Ahn J, Lee H, Kim S, Park J, Ha T, The anti-obesity effect of quercetin is mediated by the AMPK and MAPK signaling pathways, Biochem. Biophys. Res. Commun., 373(4) p545-549, 2008
2. Gao Y, Zhou Y, Xu A, Wu D., Effects of an AMP-activated protein kinase inhibitor , compound C, on adipogenic differentation of 3T3-L1 cells., Biol. Pharm. Bull., 31(9) p1716-1722, 2008
3. Madsen L. et al., Obesity: genomics and postgenomics., Informa Healthcare USA Inc. New York, 1() p429-450, 2007
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제목 3T3-L1 fibroblast 세포배양 및 분화 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Olympus), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), 액체질소탱크(Cryogenics), Cryotube(Nunc), 배양 플라스크(T25/T75, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 6 well plate(BD falcon), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen)
 
필요시약
DMEM(Gibco), calf serum(Gibco), fetal bovine serum(Gibco), methylisobutylxanthine(Sigma), dexamethasone(Sigma), insulin(Sigma), sodium pyruvate(Gibco), tryphan blue(Gibco), penicillin/streptomycin/glutamin(Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA(Gibco), PBS(Sigma), DMSO(Sigma)
 
실험방법
1. 배지 제조
1) 증식용 배지: 10% calf serum/DMEM
2) 분화용 배지: 10% FBS/DMEM(115 μg/ml methylisobutylxanthine, 1 μg/ml Insulin, 1 μM dexamethasone)
Tips:
- 115 μg/ml methylisobutylxanthine: 0.0115 g/ml 0.5N KOH를 1:100의 비율로 배지에 첨가한다.
- 1 μg/ml Insulin: 1 mg/ml 0.02 M HCl를 1:1000의 비율로 배지에 첨가한다.
- 1 μM dexamethasone: 10 mM dexamethasone (100% ethanol)를 제조한 후, PBS로 1mM이 되게 희석한다. 이를 1:1000의 비율로 배지에 첨가한다.
 
2. 동결세포 해동 및 배양
* 10% FBS/DMEM 증식용 배지 사용
1) 액체질소 탱크에 보관된 3T3-L1 fibroblast를 꺼내어, 곧바로 37℃ 항온수조기에 넣고 녹인다.
Tips:
- 항온수조기의 온도를 미리 37℃로 셋팅한다.
- 배지도 미리 데워둔다.
2) Vial속 배지가 거의 녹았을 때, 항온수조기에서 꺼내어 70% 에탄올로 소독하고 무균작업대로 신속하게 옮긴다.   
3) 배지에 세포를 풀고, 1000 rpm에서 3분간 원심분리한다.
4) 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 다시 배지를 넣고 pipetting하여 single cell로 만든다.
5) 배지 5 ml를 넣은 배양 플라스크(T25)에 세포현탁액을 넣은 다음, 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 잘 섞어준다.
6) 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.
7) 3T3-L1 fibroblast가 배양 플라스크 면적의 70~80%정도 차지하면 계대배양한다.
Tips:
- 세포가 배양 플라스크에 꽉차지 않게, 70~80%를 유지하는 것이 중요함.
8) 먼저, 배지를 버리고 PBS로 washing한다.
9) PBS를 버리고 0.05% trypsin-EDTA 1ml를 처리하여 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 3분간 방치한다.
10) 세포가 잘 떨어졌는지 확인하고 미리 데워둔 배지를 첨가한다.
Tips:
- FBS가 들어있는 배지를 처리하는 것은 trypsin 반응을 중지시키기 위함이다.
11) 세포현탁액을 tube에 모아 1000 rpm에서 3분간 원심분리한다.
12) 원심분리 후에, 상층액을 제거하고 배지를 넣어 세포를 풀어준다.
13) 배지 10 ml를 넣은 배양 플라스크(T75)에 세포현탁액을 넣고, 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 섞어준다.
14) 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.
 
3. 지방세포 분화 유도
1) 배양한 3T3-L1 fibroblast를 6 well plate에 well당 5 × 105cells이 되도록 분주한다.
Tips:
- 세포수를 측정할 때, tryphan blue 시약을 사용한다. Tryphan blue는 죽은 세포를 염색하기 때문에 살아있는 세포만을 셀 수 있다. 세포현탁액과 tryphan blue를 1:1의 비율로 섞어 사용한다.
2) 세포가 부착되면 배지를 교환해 주고,꽉 찰 때까지 배양한다.
Tips:
- 세포가 가득차지 않은 상태에서 분화를 유도하면 분화가 잘 되지 않는다.
- 계대수가 낮은 세포(passage 10 이하)를 사용하는 것이 분화가 더 잘 된다.
3) 세포가 꽉찬 후 2-3일을 기다렸다가 methylisobutylxanthine, insulin, dexamethasone이 함유된 10% FBS/DMEM 분화용 배지로 교환하여 2일 더 배양한다. (Day 0)
Tips:
- 세포의 형태가 둥글게 변화되는 것을 관찰할 수 있다.
- Methylisobutylxanthine, insulin, dexamethasone은 fresh한 상태로 사용하는 것이 더 좋으므로 실험시 만들어 사용한다.
4) 10% FBS/DMEM 배지에 1 μg/ml Insulin이 함유된 배지로 교환하여 2일 더 배양한다. (Day 2)
Tips:
- Insulin이 함유된 배지로 교환한 뒤부터, 세포내에 지방구가 차는 것을 관찰할 수 있다.
5) 10% FBS/DMEM 배지에로 교환하여, 2일 더 배양한다.(Day 4)
6) 5)과정을 반복한다.(Day 6)
7) 2~3일 후에 완전히 분화된 지방세포를 관찰할 수 있다. (Day 8~9)
Tips :
- 분화 여부를 확인하기 위해 현미경 관찰뿐만 아니라, Oil-Red O 염색을 통해서도 확인하도록 한다.
실험결과 예
1. 현미경 관찰 예
o 분화전 (preadipocyte)
o 분화 후 (8 days)
좋은 예
나쁜 예
 
2. Oil-Red O 염색 예
o 분화가 잘 된 예
o 분화가 잘 되지 않은 예
 
       
           
결과해석
현미경 관찰 및 Oil-Red O 염색을 통해 세포내에 지방구가 축적된 것이 확인되면, 지방세포로 분화된 것으로 판단할 수 있다 
참고문헌
첨부파일
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