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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 표피 각화세포에서 HAS2 단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 피부보습
실험배경
피부노화는 개인의 유전적 차이에 의해 발생하는 내재적 노화와 햇빛이나 대기오염 같은 외부 요인에 의해 발생하는 외재적 노화가 있다. 외재적 노화는 자외선에 의한 경우가 대부분이기 때문에 광노화(Photoaging)와 같은 말로 사용된다. 피부 노화의 결과로 콜라겐이 감소되어 피부 탄력이 떨어지고 주름이 생기며 수분 손실이 증가한다. 따라서 콜라겐 합성을 증가 시키고 분해를 억제하며 피부의 보습인자를 증가시키는 것은 피부노화 예방을 위한 좋은 전략이 될 수 있다. 항 피부노화 효능을 간접적으로 평가를 위한 방법으로 후보물질을 인간 표피 각화세포주인 HaCaT에 처리하여 HAS2(Hyaluronan synthase) mRNA의 발현 증가 효과를 측정한다. 피부 장벽의 기능이 훼손됨에 따라 각화세포의 수분보유능력이 떨어지고 경피 수분 손실량이 증가하게 되어 피부건조증이 일어나게 되는데 천연 보습인자인 히알루론산(Hyaluronan)이 강력한 수분보유량을 지니고 있어 피부 건조를 방지한다. HAS2mRNA의 발현을 RT-PCR 기법을 통해 측정할 수 있다.
대상 세포주인 HaCaT은 인간 표피에서 얻어지는 세포 주로서 배양조건이 까다롭지 않고 실제로 인간을 대상으로 하는 기능성 식품의 연구를 위해서는 다른 동물에서 얻어진 세포보다는 인간에서 얻어진 세포를 대상으로 연구를 하는 것이 후보물질의 활성을 평가하는데 좀 더 정확한 실험법이 될 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, Transfer 장치, Cell culture dish, X-ray film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film, OHP film
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein assay, PROTEIN-transfer buffer, cell lysis buffer (10X), ECL plus reagent, Skim milk, Tris buffer with Tween 20 (TBST), HAS2 rabbit polyclonal antibody, Monoclonal anti0actin, goat anti-rabbit IgG-HRP, Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate, VIVID developer, VIVID fixer, methyl alcohol
 
세포주
Human keratinocyte cell
 
실험방법
1. 세포를 적정한 수로 dish 에 배지와 함께 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish70-80% 정도 밀도가 되면 serum-free 배지로 24시간 starvation 한다.
3. Sample 을 포함한 배지로 바꿔서 sample 을 처리한 후 3시간 동안 배양한다.
4. Cell lysis 후 단백질 양을 정량하여 SDS sample buffer 에 동량을 섞어준다.
5. 5분간 heat boiling 해준 후 얼음에서 냉각해준다.
6. 10 % SDS-polyacrylamide gel loading PVDF membrane 으로 transfer 한다.
7. Membrane 5% skim milk solution 2시간 blocking 을 해준 후 5% skim milk 에 희석된 HAS antibody4overnight 해준다.
8. TBST solution30분간 shaking washing 을 해준 후 2antibody를 붙여준다.
9. 암실에서 ECL plus solution 을 이용하여 반응을 시켜주며 western blot film에 결과를 도출해낸다.
결과해석
Western blotting 기법을 이용하여 HAS2 의 발현을 확인하는 실험으로 filmband 형태로 HAS2의 발현이 나타나게 된다. 따라서 HAS2 band intensity를 통해 시료에 의한 HAS2 의 발현정도를 확인할 수 있다.  HAS2는 히알루론산 합성효소로 피부 보습에 중요한 역할을 하므로, HAS2의 발현량이 높을 수록 피부 보습력이 높아진다고 간접적으로 판단할 수 있다. 
참고문헌 1. Kim S, Kang BY, Cho SY, Sung DS, Chang HK, Yeom MH, Kim DH, Sim YC, Lee YS, Compound K induces expression of hyaluronan synthase 2 gene in transformed human keratinocytes and increases hyaluronan in hairless mouse skin, Biochem Biophys Res Commun., 316(2) p348-355, 2004
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제목 인간 표피 각화세포에서 HAS2 단백질 발현 측정 링크 피부보습
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope) (범용), 세포 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), SDS-PAGE-전기영동장치 (범용), Transfer 장치 (범용), Cell culture dish (Falcon), X-ray film (AGFA), Cassette (선경), PVDF membrane (Pall corporation), Agfa medical X-ray film (AGFA), OHP film (범용)
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (Gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), DC Protein assay (bio rad), PROTEIN-PAGE-10% (바이오세상), PROTEIN-PAGE-5% stacking gel (바이오세상), 5X SDS loading buffer (바이오세상), 10X tris-Glycine buffer (바이오세상), 4X transfer buffer (바이오세상), Cell lysis buffer (바이오세상), ECL plus reagent (amersham), Skim milk (Sigma), Tris buffer with tween 20 (TBST) (cell signal), HAS2 rabbit polyclonal antibody (santa cruz), monoclonal anti-beta-actin (sigma), goat anti-rabbit IgG-HRP (santa cruz), Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP Conjugate (Invitrogen), VIVID DEVELOPER (VIVID), VIVID FIXER (VIVID), Methyl alcohol (Duksan)
 
실험방법
(배지조성)
배양용 배지 : DMEM 배지 450 mLFBS 50 mL, Antibiotic (Strep./Peni.) 5mL을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM 배지에 Antibiotic (Strep./Peni.) 5mL을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 사용한다.
 
1. 세포 배양, 시료 처리, 단백질 prep
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 cell1 x 105seeding한 후 48시간 후에 serum starvation24시간 한다.
2) Serum starvation된 세포에 처리할 시료를 starvation 배지에 적정 농도로 섞은 후 배양기에서 3시간 동안 배양한다.
3) 배지를 suction 한 후 Cold PBS 2 ml2washing 해 준다.
4) 남아 있는 PBS를 완전히 제거한 후 cell lysis buffer 80 ul 를 넣고 얼음판 위에 올려놓는다.
5) 얼음 위에서 scraper를 이용하여 6 cm 배양 접시의 세포를 긁어 모아 tube에 담아 얼음에서 10 분에 한번씩 총 3vortexing 해준다.
6) 14000 rpm, 10 min 으로 centrifuge 하고 상층액을 다른 tube로 옮긴다.
 
2. Loading, Blotting
1) 농축된 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량 후 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gelLoading 하고 90V 20, 110V90분 전기영동 한다.
*10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
 - SDS-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 mL : 40 uL : 8 uL의 비율로 50 mL tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다.
- Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다.
- 5% stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 mL : 50 uL : 4 uL)1000 uL pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
4) 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
* Transfer 방법
<스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA100~120transfer 한다.
1) PVDF Membrane을 메탄올에 담궈 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)2시간 blocking 을 해준다.
2) HAS2 antibody5% skim milk-TBST solution1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가 4에서 gently shaking overnight 한다.
3) TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
4) 2anti goat antibody5% skim milk1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 배양한다.
5) 1시간 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
 
3. Film 현상
* Developer, Fixer, 카세트, membrane 2개의 OHP film, ECL plus, pipetter, 물통을 준비한다.
1) 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
2) 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
3) 불을 끄고 developerfixer를 각각의 통에 넣는다.
4) E-tubeECL + A 500 ulB 12.5 ul를 섞는다.
5) 폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagentmembrane에 골고루 뿌려준다.
6) 핀셋으로 membrane 끝 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
7) 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
8) 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
9) 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
10) 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.
실험결과 예
출처 : Kim S et al., 2004
결과해석
Western blotting을 통해 HAS2의 발현양 변화를 확인할 수 있다. Control에 비해 기능성 소재 물질을 처리한 실험군에서 HAS2의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다.
참고문헌 1. Kim S, Kang BY, Cho SY, Sung DS, Chang HK, Yeom MH, Kim DH, Sim YC, Lee YS, Compound K induces expression of hyaluronan synthase 2 gene in transformed human keratinocytes and increases hyaluronan in hairless mouse skin, Biochem Biophys Res Commun., 316(2) p348-355, 2004
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