국민의 더 안전하고 건강한 삶을 위한
건강기능식품 플랫폼

  • 통합검색
  • 인정현황
  • 내게맞는실험법
  • 기능지표성분분석법
  • top

피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포 배양법
구분 피부건강 링크 기초실험법
실험배경
Human dermal fibroblast (HDF)은 사람의 피부 진피에서 얻은 일차 진피세포(primary dermal fibroblast cells)10-20 passage 후 분화되어 버리기 때문에 제한된 계대수 (passage number)를 가지고 있다. 기하지만, 인간진피에서 직접 분리한 세포이기 때문에 in vitro에서 주름과 관련된 실험을 하기에는 적합한 세포 주이다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 배양기, 무균작업대 (Clean bench), 항온수조기 (water bath), 원심분리기, Deep freezer, 질소탱크, cryo 1Freezing container, 10 cm 배양 접시, T25 Flask, Cryotube
 
필요시약
DMEM media, fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Phosphate buffered saline (PBS), 0.5% trypsin-EDTA   
세포주
Human dermal fibroblast cell
 
실험방법 1. 배양 접시에 세포가 80-90% 정도 밀도로 성장하면 계대 배양 한다.
2. 배지를 제거하고 PBS 4 mL로 한 번 washing 해 준다.
3. 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 뗀 후 배지로 중화시킨다.
4. 세포를 tube에 모아 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.
5. 배지 상층액을 제거하고 새 배지를 넣어 세포를 풀어준다.
6. 세포 현탁액과 배지를 적정 비율로 섰어 배양 접시에 골고루 잘 퍼지도록 한다.
7. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.
Tips:
-  상태가 좋은 세포는 동결시켜 보관하고, 필요할 때 해동하여 사용한다.
결과해석
세포가 길쭉한 모양으로 부착되어서 자라는 것을 확인할 수 있다.
참고문헌 1. 박경수, 홍사민, 이주카요코, 김찬윤, 성공제, 인간 섬유아세포에 대한 마이토마이신 C와 피르페니돈의 독성과 항섬유화효과, 대한안과학회지, 55(7) p1077-1083, 2014
2. 김윤정, 이유리, 천종우, 이현상, 피부 섬유아세포에서 광나무 추출물의 항 노화 효과, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 36(4) p295-301, 2010
목록보기
제목 인간 진피 섬유아세포 배양법 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope) (범용), 배양기 (범용), 무균작업대 (범용), 항온수조기 (범용), 원심분리기 (범용), Deep freezer (범용), 질소탱크 (범용), Cryo 1 Freezing container (NALGENE), 10 cm 배양접시 (SPL), T25 flask (SPL), Cryotube (NUNC)
 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (Gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (JUNSEI) 
실험방법
(배지 조성)
배양용 배지 : DMEM배지 450 mLFBS 50mL, Antibiotic(Strep./Peni.) 5 mL을 맞게 첨가 하고 잘 흔들어준 후 사용한다.
 
1. 동결세포의 해동 (Thawing)
* 실험 시작 전 배지를 37항온수조기(water bath)에 미리 데워둔다
1)  액체질소 탱크에 보관된 HDF 세포(vial)을 꺼낸다.
2)  1 ml씩 나눠 있는 vial을 조심히 꺼내 곧바로 37항온수조기에 넣고 녹인다. (이때, vial 속의 배지가 완전히 녹으면 안 된다.)
3)  Vial 속의 배지가 거의 녹았을 때 항온 수조기에서 꺼내어 vial 외부를 70% 알코올로 소독하고 무균작업대로 신속히 옮긴다.
4)  Vial의 세포 1 ml을 모아 37에 미리 데워놓은 4 ml 배지(15 ml tube)에 세포를 풀어준다
5)  세포현탁액을 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 해준다.
6)  세포잔사는 남기고 배지 상층액을 조심스럽게 suction하여 제거한다.
7)  튜브에 미리 데워준 배지 4 ml을 넣고 세포를 풀어준다. 이 때 거품이 생기지 않도록 천천히 파이펫팅하여 세포를 잘 섞어준다.
8)  배양용 접시(T-25 cm2 flask)에 접종한 다음 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 모양으로 잘 섞어 준다.
9) 현미경으로 세포가 한 곳으로 모이지 않고 잘 접종 되었는지를 확인하고 70% 알코올로 소독한 다음 37, 5% CO2배양기에서 배양한다.
 
2. 세포 계대배양 (Subculture)
* Media, PBS37항온수조기에 데운다.
1) 세포의 밀도가 70-80%가 되면 배양접시를 살짝 기울여 배지를 제거해준다.
2) 1X PBS(Phosphate buffer saline) 4 ml로 한 번 헹궈준다.
* PBS가 세포에 직접 닿으면 세포가 떨어져 나갈 수 있으므로 PBS를 배양접시 벽면을 따라 흘려 넣어 주도록 한다.
3) 0.05% trypsin-EDTA(1 ml)을 처리하여 37, 5% CO2 배양기에서 10분간 배양한다.
4) 세포가 잘 떨어졌는지 확인하고 미리 데워준 4 ml 배지로 중화(trypsin 반응 중지) 시킨다.
* 이때 세포를 떨어뜨리기 위해 흔들거나 dish에 충격을 주지 않는다.
5) 세포가 들어있는 세포현탁액을 다시 튜브(15 ml)에 모아 1,000 rpm에서 3분간 원심분리한다.
6) 상층 배지를 조심스럽게 제거한다.
7) 미리 데워 놓은 배지 5 ml을 첨가하여 세포를 풀어준다. 이 때 거품이 생기지 않도록 천천히 파이펫팅 하여 뭉쳐진 세포를 잘 떨어지도록 한다.
8) 세포현탁액 1 ml에 미리 데워진 배지 7 ml을 잘 섞어 배양용 접시에 뿌린 다음 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 모양으로 잘 섞어 준다.
9) 현미경으로 세포가 한 곳으로 모이지 않고 일정 밀도로 잘 퍼져 있는지를 확인하고 70% 알코올로 잘 소독한 다음 37, 5% CO2 배양기에서 배양한다.
* 세포밀도가 70-80% 가되면 주기적으로 계대 배양하도록 한다.
 
3. 세포의 동결보존 (Freezing)
1) 세포 계대배양과 동일한 과정으로 (~)으로 세포를 준비 한 다음, 동결보존용 배지에 풀어준다
* 동결보존용 배지 : DMSO (Dimethyl sulfoxide) 10%, FBS 40%, Media 50%로 저장 (일반적으로 DMSO 10%, Culture medium 90%로도 저장
세포동결 보존 시 DMSO를 넣어주는 이유는 세포 외액에 얼음 결정이 형성될 때 발생하는 삼투압 스트레스로 인한 세포 손상을 막아주고 세포에 치명적인 세포 내 얼음 결정 형성을 억제시키기 위해서다
2) 동결보존용 배지에 풀어준 세포 현탁액을 동결보존용 vial1 ml씩 분주한다.
* 세포 동결 시 vial에 정확한 날짜와 동결시키는 실험자를 정확하게 기입하도록 한다.
3) 세포(vial)Cryo 1Freezing container에 넣어 -80deep freezer에서 하루 정도 둔 다음, 다음날 아침 질소탱크(-196)로 옮겨 저장한다.
실험결과 예

결과해석
세포가 길쭉한 모양으로 고르게 부착되어서 자라는 것을 확인할 수 있다.
참고문헌
첨부파일
목록보기