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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포 배양법
구분 피부건강 링크 기초실험법
실험배경
Human dermal fibroblast (HDF)은 사람의 피부 진피에서 얻은 일차 진피세포(primary dermal fibroblast cells)로 10-20 passage 후 분화되어 버리기 때문에 제한된 계대수 (passage number)를 가지고 있다. 기하지만, 인간진피에서 직접 분리한 세포이기 때문에 in vitro에서 주름과 관련된 실험을 하기에는 적합한 세포 주이다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 배양기, 무균작업대 (Clean bench), 항온수조기 (water bath), 원심분리기, Deep freezer, 질소탱크, cryo 1℃ Freezing container, 10 cm 배양 접시, T25 Flask, Cryotube
 
필요시약
DMEM media, fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Phosphate buffered saline (PBS), 0.5% trypsin-EDTA   
세포주
Human dermal fibroblast cell
 
실험방법 1. 배양 접시에 세포가 80-90% 정도 밀도로 성장하면 계대 배양 한다.
2. 배지를 제거하고 PBS 4 mL로 한 번 washing 해 준다.
3. 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 뗀 후 배지로 중화시킨다.
4. 세포를 tube에 모아 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 한다.
5. 배지 상층액을 제거하고 새 배지를 넣어 세포를 풀어준다.
6. 세포 현탁액과 배지를 적정 비율로 섰어 배양 접시에 골고루 잘 퍼지도록 한다.
7. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.
Tips:
-  상태가 좋은 세포는 동결시켜 보관하고, 필요할 때 해동하여 사용한다.
결과해석
세포가 길쭉한 모양으로 부착되어서 자라는 것을 확인할 수 있다.
참고문헌 1. 박경수, 홍사민, 이주카요코, 김찬윤, 성공제, 인간 섬유아세포에 대한 마이토마이신 C와 피르페니돈의 독성과 항섬유화효과, 대한안과학회지, 55(7) p1077-1083, 2014
2. 김윤정, 이유리, 천종우, 이현상, 피부 섬유아세포에서 광나무 추출물의 항 노화 효과, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 36(4) p295-301, 2010
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제목 인간 진피 섬유아세포 배양법 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope) (범용), 배양기 (범용), 무균작업대 (범용), 항온수조기 (범용), 원심분리기 (범용), Deep freezer (범용), 질소탱크 (범용), Cryo 1℃ Freezing container (NALGENE), 10 cm 배양접시 (SPL), T25 flask (SPL), Cryotube (NUNC)
 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (Gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (JUNSEI) 
실험방법
(배지 조성)
배양용 배지 : DMEM배지 450 mL에 FBS 50mL, Antibiotic(Strep./Peni.) 5 mL을 맞게 첨가 하고 잘 흔들어준 후 사용한다.
 
1. 동결세포의 해동 (Thawing)
* 실험 시작 전 배지를 37℃ 항온수조기(water bath)에 미리 데워둔다
1)  액체질소 탱크에 보관된 HDF 세포(vial)을 꺼낸다.
2)  1 ml씩 나눠 있는 vial을 조심히 꺼내 곧바로 37℃ 항온수조기에 넣고 녹인다. (이때, vial 속의 배지가 완전히 녹으면 안 된다.)
3)  Vial 속의 배지가 거의 녹았을 때 항온 수조기에서 꺼내어 vial 외부를 70% 알코올로 소독하고 무균작업대로 신속히 옮긴다.
4)  Vial의 세포 1 ml을 모아 37℃에 미리 데워놓은 4 ml 배지(15 ml tube)에 세포를 풀어준다
5)  세포현탁액을 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 해준다.
6)  세포잔사는 남기고 배지 상층액을 조심스럽게 suction하여 제거한다.
7)  튜브에 미리 데워준 배지 4 ml을 넣고 세포를 풀어준다. 이 때 거품이 생기지 않도록 천천히 파이펫팅하여 세포를 잘 섞어준다.
8)  배양용 접시(T-25 cm2 flask)에 접종한 다음 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 ∞ 모양으로 잘 섞어 준다.
9) 현미경으로 세포가 한 곳으로 모이지 않고 잘 접종 되었는지를 확인하고 70% 알코올로 소독한 다음 37℃, 5% CO2배양기에서 배양한다.
 
2. 세포 계대배양 (Subculture)
* Media, PBS를 37℃ 항온수조기에 데운다.
1) 세포의 밀도가 70-80%가 되면 배양접시를 살짝 기울여 배지를 제거해준다.
2) 1X PBS(Phosphate buffer saline) 4 ml로 한 번 헹궈준다.
* PBS가 세포에 직접 닿으면 세포가 떨어져 나갈 수 있으므로 PBS를 배양접시 벽면을 따라 흘려 넣어 주도록 한다.
3) 0.05% trypsin-EDTA(1 ml)을 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 10분간 배양한다.
4) 세포가 잘 떨어졌는지 확인하고 미리 데워준 4 ml 배지로 중화(trypsin 반응 중지) 시킨다.
* 이때 세포를 떨어뜨리기 위해 흔들거나 dish에 충격을 주지 않는다.
5) 세포가 들어있는 세포현탁액을 다시 튜브(15 ml)에 모아 1,000 rpm에서 3분간 원심분리한다.
6) 상층 배지를 조심스럽게 제거한다.
7) 미리 데워 놓은 배지 5 ml을 첨가하여 세포를 풀어준다. 이 때 거품이 생기지 않도록 천천히 파이펫팅 하여 뭉쳐진 세포를 잘 떨어지도록 한다.
8) 세포현탁액 1 ml에 미리 데워진 배지 7 ml을 잘 섞어 배양용 접시에 뿌린 다음 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 ∞ 모양으로 잘 섞어 준다.
9) 현미경으로 세포가 한 곳으로 모이지 않고 일정 밀도로 잘 퍼져 있는지를 확인하고 70% 알코올로 잘 소독한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.
* 세포밀도가 70-80% 가되면 주기적으로 계대 배양하도록 한다.
 
3. 세포의 동결보존 (Freezing)
1) 세포 계대배양과 동일한 과정으로 (①~⑥)으로 세포를 준비 한 다음, 동결보존용 배지에 풀어준다. 
* 동결보존용 배지 : DMSO (Dimethyl sulfoxide) 10%, FBS 40%, Media 50%로 저장 (일반적으로 DMSO 10%, Culture medium 90%로도 저장) 
☞ 세포동결 보존 시 DMSO를 넣어주는 이유는 세포 외액에 얼음 결정이 형성될 때 발생하는 삼투압 스트레스로 인한 세포 손상을 막아주고 세포에 치명적인 세포 내 얼음 결정 형성을 억제시키기 위해서다. 
2) 동결보존용 배지에 풀어준 세포 현탁액을 동결보존용 vial에 1 ml씩 분주한다.
* 세포 동결 시 vial에 정확한 날짜와 동결시키는 실험자를 정확하게 기입하도록 한다.
3) 세포(vial)를 Cryo 1℃ Freezing container에 넣어 -80℃ deep freezer에서 하루 정도 둔 다음, 다음날 아침 질소탱크(-196℃)로 옮겨 저장한다.
실험결과 예

결과해석
세포가 길쭉한 모양으로 고르게 부착되어서 자라는 것을 확인할 수 있다.
참고문헌
첨부파일
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