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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포에서 세포독성 측정
구분 피부건강 링크 기초실험법
실험배경
피부는 환경독소나 자외선 등에 직접 노출되기 때문에 이로 인해 발생하는 활성산소와 염증반응의 정도가 다른 조직에 비해 매우 높은 편이며, 최근 수질오염과 오존층 파괴 등 환경적 위험 요인의 증가에 의해 피부 노화가 촉진되고 있다.
피부는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis), 피하조직층(subcutaneous layer)으로 구분할 수 있는데 이 중 피부의 표피층은 끊임없이 재생되어 떨어져 나가는데 비해 진피층은 섬유성분과 기질성분으로 구성되어 있으며 진피에 분포하는 모세혈관과 신경이 표피에 영양분을 보충해 주므로 피부의 노화와 밀접한 관련이 있다.
피부주름은 UVB와 같은 외부요인에 의해 피부 구조를 유지하는 섬유아 세포가 파괴되거나 피부 진피층의 70% 이상을 차지하여 피부 항상성을 유지하는 콜라겐과 탄력섬유의 합성이 감소되고 세포 외 기질단백질의 분해 효소인 Matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가한다. 따라서 피부 진피층의 섬유 아세포의 과다한 기질분해 효소를 억제하고 콜라겐 전구체의 발현을 조절하는 것은 여러 자극에 대한 피부건강을 유지하는데 중요한 지표가 될 수 있다. 항노화에 대한 효능 평가를 위한 방법으로는 후보물질을 인간 진피 섬유 아세포주인 HDF에 처리하여 유도된 Procollagen의 발현효과를 western blotting 기법을 통해 측정할 수 있다.
 대상 세포주인 HDF는 인간 진피 섬유 아세포로서 진피 윗부분에 주로 많이 분포하며 콜라겐, 탄력섬유, 글리코스아미노글리칸과 같은 구조물질을 합성한다. 다른 피부 세포 주들에 비해 제한된 계대수(Passage number)를 가지기 때문에 주기적으로 세포를 교환해야 하지만 인간 진피층에서 분리한 세포이기 때문에 in vitro에서 주름과 관련된 실험을 하기에는 가장 적합한 세포 주이다.
콜라겐은 인체의 뼈와 피부를 구성하는 아미노산으로 된 단백질로서 세포와 세포를 연결하는 고리 같은 역할을 하며 18세 이후부터 자체 생산이 저하되며 콜라겐이 부족하거나 억제되며 주름이 발생하게 된다. 따라서 피부 진피내의 콜라겐 합성 유도능을 측정하는 실험도 주름개선에 한 방법이라 할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope, 원심분리기, ELISA leader, 세포 배양기, 96-well plate, Cell culture dish, Syringe filter 0.20, 25mm 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Penicillin/streptomycin, MTT powder, Dimethyl sulfoxide(DMSO), Phosphate buffered saline(PBS) 
세포주
Human dermal fibroblast cell   
실험방법
1. 96-well plate200 μL씩 세포를 seeding한다.
2. 70~80% 정도 세포가 자라면 serum-free 100^μL을 첨가하여 starvation 한다.
3. 다음날 시료를 농도별로 처리 후 48시간 동안 배양한다.
4. 배양 후, MTT solution을 각 well20 μl씩 첨가 후 2시간 동안 다시 배양한다.
5. 배지를 모두 제거한 후 DMSO를 각 well200 μl씩 첨가 한다
6. 30분 동안 shaking시킨다.
7. Microplateleader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정한다.
결과해석
세포독성을 측정하는 방법으로는 ELISA leader를 통해 시료를 처리하지 않은 well의 흡광도에 대한 시료를 처리한 well 에서의 흡광도(570 nm)를 백분율로 비교 할 수 있다. 따라서 그 비율이 80 % 미만이 될 때에는 세포독성을 나타낸다고 추정할 수 있다.
참고문헌 1. 김윤정, 이유리, 천종우, 이현상, 피부 섬유아세포에서 광나무 추출물의 항 노화 효과, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 36(4) p295-301, 2010
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제목 인간 진피 섬유아세포에서 세포독성 측정 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope) (범용), 원심분리기 (범용), ELISA leader (범용), 세포배양기 (범용), 96-well plate (SPL), Cell culture dish (Falcon), Sytinge filter 0.20, 25mm (adventec) 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), MTT powder (Sigma), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (JUNSEI), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상) 
실험방법 1. 배지 조성
배양용 배지 : DMEM배지 450 ml에 10% FBS (50 ml), 0.2% Antibiotic(Strep./Peni.) (5 ml)을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어 준 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM배지에 0.2% Antibiotic(Strep./Peni.) (5 ml) 을 각 농도에 맞게 첨가하여  잘 흔들어 준 후 사용한다.
 
2. MTT solution
1) 빈 50 ml tube를 호일을 이용하여 싼다.
2) Water bath에 미리 데워 둔 Phosphate buffered saline (1X) 40 ml에 MTT powder를 0.2 g 넣는다.
3) MTT powder가 다 녹을 때까지 votexer를 이용하여 잘 섞어준다.
4) Ethyl alcohol을 latex glove를 낀 손과 50 ml tube, Syringe filter, 10 ml syringe에 골고루 분사 후 무균작업대(clean bench) 안에서 10 ml syringe에 filter를 꽂은 후 PBS와 MTT powder를 섞은 용액을 넣고 filtering 한다.
 
3. MTT assay
1) 무균작업대(clean bench) 안에서 배양된 Dermal Fibroblast Normal을 multipipette을 이용하여 20 μl씩 seeding한다.
2) Seeding한 plate를 배양기에서 하루나 이틀 정도 배양 후 세포가 70~80%정도 차면 serum-free배지를 각 well에 100 μl씩 첨가하여 starvation 한다.
3) 배양기에서 하루 배양 후 효능을 보고자 하는 시료를 각 농도에 맞게 처리 후 48시간 동안 배양기 안에서 배양시킨다.
4) 48시간 후에 미리 만들어 놓은 MTT solution을 각 well당 20 μl씩 첨가하는 데 MTT solution을 넣을 때에는 주위의 모든 불을 다 끄고 solution을 넣은 96-well plate는 호일로 싸서 빛을 차광 후 2시간 동안 배양기에 배양한다.
5) 2시간 뒤에, 배지를 모두 제거한 후 DMSO를 각 well 당 200 μl씩 첨가 후 30분 동안 shaker를 이용하여 섞어준다.
6) ELISA leader 570 nm에서 흡광도를 측정한다.
실험결과 예
1.jpg
결과해석 Human dermal fibroblast 세포에 시료를 농도 별로 처리하였을 때 시료를 처리하지 않은 well의 흡광도에 대한 시료를 처리한 well 에서의 흡광도(570 nm)를 백분율로 비교하였다. 시료 5 uM 이하 까지는 세포 viability가 80% 이상이 되는 것로 보아 독성을 타나태지 않는 것을 확인하였다.
참고문헌
첨부파일
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