1. 배지 조성
배양용 배지 : DMEM배지 450 ml에 FBS 50 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 5 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM배지에 Antibiotic(Strep./Peni.) 5 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들고 24시간 정치 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 단백질 prep
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 cell을 1 x 105개 seeding한 후 48시간 후에 serum starvation을 24시간 한다.
2) Serum starvation된 세포에 처리할 시료를 starvation 배지에 적정 농도로 섞은 후 배양기에서 48시간 동안 배양한다.
3) 14000 rpm, 10 min 으로 centrifuge 해 배지 안의 죽은 세포를 침전시킨 후 상층액을 다른 tube로 옮긴다.
4)  배양한 배지를 2ml tube에 담아 speedvac 농축기를 이용하여 500ul까지 농축시킨다.
 
3. Loading, Blotting
1) 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 100^ug 농도가 되도록 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95℃에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
Tips:
- 10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
SDS-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 ml : 40 ul : 8 ul의 비율로 50 ml tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다.
Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다.
5% Stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 ml :50 ul : 4 ul)을 1000 ul pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.

4. 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
Tips:
-Transfer 방법
스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA로 100~120분 transfer 한다.
5. PVDF Membrane을 메탄올에 담가 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)에 2시간 blocking 을 해준다.
6. MMP-1 antibody를 5% skim milk-TBST solution에 1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가 4℃에서 overnight으로 gently shaking한다.
7. TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
8. 2차 anti goat antibody를 5% skim milk에 1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 배양한다.
9. 2차 antibody를 붙인 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
10. Film 현상
Tips:
- Developer, Fixer, 카세트, membrane당 2개의 OHP film, ECL +, pipette, 물 통을 준비한다.
1) 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
2) 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
3) 불을 끄고 developer와 fixer를 각각의 통에 넣는다.
4)  E-tube에 ECL + A 500 ul와 B 12.5 ul를 섞는다.
5)  폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagent를 membrane에 골고루 뿌려준다.
6) 핀셋으로 끝에 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
7) 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
8) 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
9) 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
10) 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.

  Human dermal fibroblast 세포에 세포사멸을 일으키지 않는 UVB 조사를 통해 시간이 지남에 따라 (48 hr and 72 hr) 진피 섬유아세포의 collagenase-1 (Matrix metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현 증가를 확인하였다.
세포사멸을 일으키지 않는 UVB 조사를 통해 collagen을 분해하는 MMP-1을 유도하였고 UVB에 의한 MMP-1
발현을 억제한 것을 관찰할 수 있었다.