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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
피부는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis), 피하조직층(subcutaneous layer)으로 구분할 수 있는데 이 중 피부의 표피층은 끊임없이 재생되어 떨어져 나가는데 비해 진피층은 섬유성분과 기질성분으로 구성되어 있으며 진피에 분포하는 모세혈관과 신경이 표피에 영양분을 보충해 주므로 피부의 노화와 밀접한 관련이 있다.
피부주름은 UVB와 같은 외부요인에 의해 피부 구조를 유지하는 섬유아 세포가 파괴되거나 피부 진피층의 70% 이상을 차지하여 피부 항상성을 유지하는 콜라겐과 탄력섬유의 합성이 감소되고 세포 외 기질단백질의 분해 효소인 Matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가한다. 따라서 피부 진피층의 섬유 아세포의 과다한 기질분해 효소를 억제하고 콜라겐 전구체의 발현을 조절하는 것은 여러 자극에 대한 피부건강을 유지하는데 중요한 지표가 될 수 있다. 항노화에 대한 효능 평가를 위한 방법으로는 후보물질을 인간 진피 섬유 아세포주인 HDF에 처리하여 유도된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 발현억제 효과를 western blotting 기법을 통해 측정할 수 있다.
대상 세포주인 HDF는 인간 진피 섬유 아세포로서 진피 윗부분에 주로 많이 분포하며 콜라겐, 탄력섬유, 글리코스아미노글리칸과 같은 구조물질을 합성한다. 다른 피부 세포 주들에 비해 제한된 계대수(Passage number)를 가지기 때문에 주기적으로 세포를 교환해야 하지만 인간 진피층에서 분리한 세포이기 때문에 in vitro에서 주름과 관련된 실험을 하기에는 적합한 세포 주이다.
실험재료
필요장비 및 소모품
UVB cross-linker, Inverted microscope, 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, Vacuum 농축 장치(Speed vac), Cell culture dish, X-ray film, OHP film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Penicillin/streptomycin, 0.5% Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein Assay, PROTEIN-PAGE-10%, , PROTEIN-PAGE-5% stacking gel, 5X SDS loading buffer, 10X Tris-Glycine Buffer, 4X Transfer Buffer, Cell lysis buffer (10X), ECL + reagent, Skim milk, Tris Buffer with Tween 20(TBST), mmp-1 rabbit polyclonal antibody, goat anti-rabbit IgG-HRP, VIVID DEVELOPER, VIVID FIXER, Methyl alcohol
 
세포주
Human dermal fibroblast cell 
실험방법 1. 세포를 적정한 수로 dish 에 배지와 함께 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish에 가득차면 Sample을 포함한 배지로 바꿔서 sample을 1시간 전처리 후 UVB 0.02 J/㎠를 조사한다.
3. 48 시간 배양 후 배지를 모은다.
4. 배지의 단백질 양을 정량하여 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
5. 5분간 Heat boiling해준 후 15분간 얼음에서 냉각해준다.
6. 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 후 PVDF membrane으로 transfer한다.
7. Membrane을 5% skim milk-TBST solution에 2시간 blocking 을 해준 후 5% skim milk-TBST solution에 희석된 MMP-1 antibody에 4℃ overnight 해준다.
8. TBST solution에 30분간 shaking washing을 해준 후 2차 antibody를 붙여준다.
9. 암실에서 ECL solution을 이용하여 반응을 시켜주며 western blot film에 결과를 도출해낸다.
결과해석
Western blotting 기법을 이용하여 MMP-1의 발현을 확인하는 실험으로 filmband형태로 MMP-1의 발현이 나타나게 된다. 따라서 MMP-1band intensity를 통해 MMP-1의 발현양을 확인할 수 있다. MMP-1의 발현이 적을수록 소재의 자외선에 의한 피부개선 효능이 좋다고 할 수 있다.
참고문헌 1. Lim TG, Jung SK, Kim JE, Kim Y, Lee HJ, Jang TS, Lee KW, NADPH oxidase is a novel target of delphinidin for the inhibition of UVB-induced MMP-1 expression in human dermal fibroblasts., Experimental Dermatology, 22(6) p428-30, 2013
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제목 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1단백질 발현 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
UVB cross-linker (Vilber lourmat), Inverted microscope (범용), 세포 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), SDS-PAGE-전기영동장치 (범용), Vacuum 농축 장치(Speed vac) (범용), Cell culture dish (Falcon), X-ray film (AGFA), OHP film (범용), Cassette (선경), PVDF membrane (Pall corporation), Agfa medical X-ray film (AGFA) 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum(FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), DC Protein Assay (Bio rad), PROTEIN-PAGE-10% (바이오세상), , PROTEIN-PAGE-5% stacking gel (바이오세상), 5X SDS loading buffer (바이오세상), 10X Tris-Glycine Buffer (바이오세상), 4X Transfer Buffer (바이오세상), Cell lysis buffer (10X) (Cell signaling), ECL + reagent (amersham), Skim milk (sigma), Tris Buffer with Tween 20(TBST) (Cell signal), mmp-1 rabbit polyclonal antibody (thermo scientific), goat anti-rabbit IgG-HRP (santa cruz), VIVID DEVELOPER (VIVID), VIVID FIXER (VIVID), Methyl alcohol(Duksan) 
실험방법
1. 배지 조성
배양용 배지 : DMEM배지 450 ml에 FBS 50 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 5 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM배지에 Antibiotic(Strep./Peni.) 5 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들고 24시간 정치 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 단백질 prep
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 cell을 1 x 105개 seeding한 후 48시간 후에 serum starvation을 24시간 한다.
2) Serum starvation된 세포에 처리할 시료를 starvation 배지에 적정 농도로 섞은 후 배양기에서 48시간 동안 배양한다.
3) 14000 rpm, 10 min 으로 centrifuge 해 배지 안의 죽은 세포를 침전시킨 후 상층액을 다른 tube로 옮긴다.
4)  배양한 배지를 2ml tube에 담아 speedvac 농축기를 이용하여 500ul까지 농축시킨다.
 
3. Loading, Blotting
1) 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 100^ug 농도가 되도록 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95℃에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
Tips:
- 10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
SDS-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 ml : 40 ul : 8 ul의 비율로 50 ml tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다.
Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다.
5% Stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 ml :50 ul : 4 ul)을 1000 ul pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
4. 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
Tips:
-Transfer 방법
스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA로 100~120분 transfer 한다.
5. PVDF Membrane을 메탄올에 담가 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)에 2시간 blocking 을 해준다.
6. MMP-1 antibody를 5% skim milk-TBST solution에 1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가 4℃에서 overnight으로 gently shaking한다.
7. TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
8. 2차 anti goat antibody를 5% skim milk에 1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 배양한다.
9. 2차 antibody를 붙인 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
10. Film 현상
Tips:
- Developer, Fixer, 카세트, membrane당 2개의 OHP film, ECL +, pipette, 물 통을 준비한다.
1) 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
2) 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
3) 불을 끄고 developer와 fixer를 각각의 통에 넣는다.
4)  E-tube에 ECL + A 500 ul와 B 12.5 ul를 섞는다.
5)  폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagent를 membrane에 골고루 뿌려준다.
6) 핀셋으로 끝에 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
7) 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
8) 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
9) 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
10) 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.
실험결과 예
 
Human dermal fibroblast 세포에 세포사멸을 일으키지 않는 UVB 조사를 통해 시간이 지남에 따라 (48 hr and 72 hr) 진피 섬유아세포의 collagenase-1 (Matrix metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현 증가를 확인하였다.
세포사멸을 일으키지 않는 UVB 조사를 통해 collagen을 분해하는 MMP-1을 유도하였고 UVB에 의한 MMP-1
발현을 억제한 것을 관찰할 수 있었다.

결과해석 Western blotting을 통해 MMP-1의 발현양 변화를 확인할 수 있다. Control에 비해 UVB를 처리한 실험군에서 MMP-1의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있으며, 기능성 소재 물질을 전처리한 실험군에서는 농도가 증가할수록 MMP-1의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있다.
참고문헌 1. Lim TG, Jung SK, Kim JE, Kim Y, Lee HJ, Jang TS, Lee KW, NADPH oxidase is a novel target of delphinidin for the inhibition of UVB-induced MMP-1 expression in human dermal fibroblasts., Experimental Dermatology, 22(6) p428-30, 2013
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