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체지방감소

동물실험법

제목 변 지질측정
구분 체지방감소 링크 지방배설 촉진
실험배경
소장에서 식이지방 흡수를 억제시키거나 변으로 지방 배설을 증가시키는 것은 결과적으로 체내 지방 축적에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 의미에서 변에서 총 지질, 중성지방 및 콜레스테롤 함량을 측정하는 것은 중요하다 할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Test tube, tissue homogenizer, 감압수기, evaporator, 깔대기, 혈청분리관, filter paper, 유리 vial, 분광광도계, pipette, pipette tip, cuvette, 균질기용 튜브 및 봉(Teflon pestle), 교반기(vortex mixer)
 
필요시약
Chloroform, methanol, NaCl, ethanol, Triton X, Sodium sulfate (Na2SO4)
중성지방, 총 콜레스테롤 분석용 kit
 
세포주
 
실험방법
1. 실험동물의 희생 전 대사케이지로 옮겨 사육하며 분변을 채취한다.
Tips:
- 건조 중량이 50-100mg이 되게 충분히 채취하는 것이 좋다.
2. 모아진 분변을 동결건조한다.
- oven에서 수분 건조 후 Fume hood에서 overnight하여 완전 건조 시킬 수 있다.
3. 감압수기에 라벨링하고, 무게를 측정하여 기록해 둔다.
4.일정량의 각 분변을 식염수로 균질화한다.
5. 균질액에 folch solution(Methanol : Chloroform = 1:2 mixture)을 넣고 강하게 vortex 하여 지질을 추출한다.
- 곧바로 folch solution에 균질화하여 진행할 수도 있다.
6. 지질추출액을 3,000 rpm에서 원심분리하여 층을 분리시킨다.
7. 원심분리한 후, 위층(물층)을 제거하고 지질이 포함된 아래층(클로르포름)층을 미리 무게를 측정한 감압건
    조수기에 담는다.
8. 감압건조하여 용매를 증발시키고 무게를 측정한다.
9. 추출된 지질을 클로르포름으로 용해하여 콜레스테롤과 중성지방 분석에 사용한다.
- 클로로포름 대신 isopropanol을 사용할 수 있다.
[SOP A13084. 혈청 중성지방 측정]
[SOP A13085. 혈청 총콜레스테롤 측정]
결과해석
총지방 : 감압수기의 무게를 측정하여 총지질 함량을 계산할 수 있으며, 무게가 많이 나갈수록 변으로 배설된 총 지방함량이 높은 것을 의미한다.
콜레스테롤 및 중성지방: 흡광도가 높을수록 변으로 배설된 콜레스테롤 및 중성지방이 많음을 의미한다.
변 중 총지방, 콜레스테롤 및 중성지방 함량이 높을수록 소장에서 지질 흡수 저해로 인한 체내 지방 축적과 관련하여 설명할 수 있다.
참고문헌
목록보기
제목 변 지질측정 링크 지방배설 촉진
실험재료
필요장비 및 소모품
Test tube (Falcon), tissue homogenizer(Potter-Elven jhem homogenizer), 감압수기(Pyrex), evaporator(EYELA), 깔대기(동성과학), 혈청분리관(세원양행), filter paper(Whatman), 유리 vial(동성과학), 분광광도계(Jasco), pipette(Eppendorf), pipette tip(Eppendorf), cuvette(Agilent Technologies), 균질기용 튜브 및 봉(Corning), 교반기(Scientific industry)
 
필요시약
Chloroform(JUNSEI), methanol(JUNSEI), ethanol(JUNSEI)NaCl, Triton X(Sigma), Sodium sulfate(JUNSEI)
중성지방, 총 콜레스테롤 분석용 kit (신양화학약품)
 
실험방법
1. 실험동물의 희생 3일전 대사케이지로 실험동물을 옮겨 사육하며 변을 채취한다
 Tips: 
- 변을 채취할 때 식이에 오염되지 않도록 주의한다.
2. 채취한 변을 동결건조한다.
3. 감압수기를 라벨하고 oven(약 50℃)에서 overnignt하여 수분을 제거한다.
4. 데시케이터에 넣어 항량시킨다.
5. Chemical balance를 이용하여 소수 넷째점짜리까지 감압수기의 무게를 정확하게 측정(W1)하여 기록한다.
6. 실험에 필요한 용매를 준비한다. 
1) Folch solution (Chloroform(CHCl3): methanol = 2:1 (v/v))
2) 식염수 (0.9% NaCl)
3) Triton solution (Triton : ETOH = 1 : 3 (v/v))
7. 건조된 변 0.5g씩 취하고, 0.9% NaCl 2 ml을 넣어 조직균질기로 균질화한다.
8. 균질액을 50 ml falcon tube로 옮기고 folch solution을 20 ml을 첨가한다. 강하게 흔들어 지질이 잘 추출되도록 한다.
9. 균질액을 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 층을 분리시킨다.
10. 위층(물층)을 제거한 후, 아래층(클로르포름층)을 취하여 미리 무게를 측정한 감압수기에 담는다. 이 때, 클로르포름층의 남아있는 수분을 제거하기 위해 깔대기에 filter paper을 놓고 sodium sulfate(Na2SO4)를 적당량(약0.5~1 g정도) 취하여 CHCl3층을 내려준다.
11. Na2SO4가 마르면 클로르포름층을 evaporation하여 용매를 모두 날린다. (Temperature : 40℃)
Tips:
- evaporator가 완료되면 chloroform냄새 대신의 기름 특유의 냄새가 난다.
12. 용매를 모두 제거한 감압수기는 데시케이터에서 보관하여 수분을 완전히 제거하고, 무게(W2)를 소수점 넷째짜리까지 정확하게 측정한다.
13. 추출된 지질을 클로르포름 1 ml을 넣고 잘 녹여준다. 이 클로르포름층을 E.P. tube에 옮기고 다시 감압수기에 클로르포름 1 ml로 수기를 washing한다. Washing한 클로르포름층도 유리 vial에 모은다.
Tips:
- 채취한 클로르포름층은 냉장보관하며 sealing처리 하여 CHCl3층이 날아가지 않도록 주의하도록 한다.
14. 콜레스테롤과 중성지방 kit를 미리 실온에 꺼내어 둔다.
15. 클로르포름층을 시험관에 각각 10 μl를 취한 후 후드 또는 질소가스를 이용하여 날려 준다.
16. Triton solution을 각 40 μl씩 tube에 첨가하여, tube에 남아있는 시료가 완전히 녹을 때까지 vortexing한다. 단, standard에도 triton solution을 동량 넣어준다.
17. 측정 kit를 이용하여 혈액 분석과 같은 방법으로 측정한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13084. 혈청 중성지방 측정], [SOP A13085. 혈청 총콜레스테롤 측정]을 참조한다.
실험결과 예
1. 총 지질
 
 
2. 중성지방

 
3. 총콜레스테롤


결과해석
항비만소재가 함유된 고지방식이를 공급한 실험동물의 분변 중 총지질, 중성지방 및 콜레스테롤 함량은 고지방식이군에 비해 감소하여, 지방흡수를 저해하고 배설을 촉진시키는 효과가 있는 것으로 판단한다.
참고문헌
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