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체지방감소

동물실험법

제목 C/EBPα 단백질 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방합성 및 축적 조절
실험배경
C/EBPα는 transcriptional factor로 지방세포의 분화과정의 후반기에 발현이 촉진되어 지방세포 분화관련 유전자들의 발현을 조절한다. 이 전사인자는 PPARγ와 밀접한 관계가 있어, 서로가 서로의 발현에 영향을 준다. C/EBP와 PPARγ는 aP나 adiponectin과 같은 adipocyte specific genes을 발현시켜 지방세포를 형성한다. 비만동물의 지방조직에서 C/EBPα 발현은 높은 것으로 보고되고 있다. 따라서, 항비만 효과 측정을 위한 하나의 바이오마커가 될 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
전기영동장치, transfer 장치, power supply, glass plate, comb, spacer, cassette, membrane(PVDF 또는 nitrocellulose), 원심분리기, OHP film, pipette, pipette tip, rotary shaker, fiber pad, test tube, 3MM paper, 핀셋, ELISA reader, 96-well plate, tissue homogenizer, 분광광도계, 플라스틱통, cuvette
 
필요시약
Lysis buffer, Tris, glycerol, SDS, bromophenol blue, 2-mercaptoethanol, acrylamide, bis-acrylamide, ammonium persulfate, TEMED, glycine, Coomassie gel stain solution, methanol, buthanol, Ponceau S solution, skim milk, bovine serum albumin, NaCl, Tween20, primary antibody (C/EBPα), HRP-linked secondary antibody, ECL plus detection kit, bradford solution, Developer, Fixer, PBS(또는 TBS)
 
세포주
 
실험방법
1. 일정량의 조직을 lysis하여, 단백질을 추출하고 정량한다. [SOP A13094. 단백질 정량 (Bradford assay) 참조]
2. 정량한 단백질 샘플을 SDS-acrylamide gel에 loading하고, 전기영동한다. [SOP A13101. Western blotting 참조]
3. Membrane으로 transfer한다.
4. Transfer한 membrane을 blocking buffer로 상온에서 2시간 동안 shaking한다.
5. TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)
6. Primary antibody (C/EBPα)를 넣고 상온(또는 4℃ overnight)에서 2시간 정도 shaking한다.
7. TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복).
8. Secondary antibody를 상온(또는 4℃ overnight)에서 1시간 정도 shaking한다.
9. TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복).
10. ECL solution를 membrane에 뿌리고, cassette에 넣어 암실에서 감광시킨다.
결과해석
Western blotting 기법을 이용하여 C/EBPα 단백질 발현을 확인하는 실험으로 X-film에 나타난 band 형태로 C/EBPα  단백질 발현을 나타낸다. 따라서, C/EBPα 의 band intensity를 통해 C/EBPα 의 발현량을 확인할 수 있다. 항비만 소재에 의해 간 및 지방조직에서 C/EBPα 단백질 발현이 감소되면, 지방세포의 형성이 억제되는 것에 영향을 미칠 것으로 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Lee MS, Kim CT, Kim YH., Green tea (-)-epigallocatechin-3-gallate reduces body weight with regulation of multiple genes expression in adipose tissue of diet-induced obese mice., Ann. Nutr. Metab., 54(2) p151-157, 2009
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제목 C/EBPα 단백질 발현 측정 링크 지방합성 및 축적 조절
실험재료
필요장비 및 소모품
전기영동장치(Bio-Rad), transfer 장치(Bio-Rad), power supply(Bio-Rad), 카세트(Bio-Rad), 유리판(Bio-Rad), comb(Bio-Rad), PVDF membrane(Milipore), 3MM filter paper(Bio-Rad), X-ray 필름(Whatman), OHP 필름(BL-Korea), 원심분리기(Eppendorf), pipette(Eppendorf), pipette(Eppendorf), ELISA reader(TECAN), 조직 균질기(MP biomedicals), test tube(SARSTEDT), 96 well plate(BD falcon), Rotary shaker(OP-100), 분광광도계(Jasco), 핀셋, 플라스틱통
 
필요시약
Prep solution (protein extraction solution, iNtron), Tris(Sigma), glycerol(Sigma), SDS(Sigma), bromophenol blue(Sigma), 2-mercaptoethanol(Sigma), acrylamide mix(Sigma), ammonium persulfate(Sigma), TEMED(Sigma), glycine(Sigma), Coomassie gel stain solution(Sigma), methanol(Sigma), buthanol(amresco), Ponceau S solution(Sigma), skim milk(Gibco), bovine serum albumin(AMRESCO), NaCl(Sigma), Tween 20(Sigma), rabbit-C/EBPα pirmary antibody(Santa Cruz), Antirabbit IgG secondary antibody(Cell Signaling), WEST-one(ECL solution, iNTRON), TBS(또는 PBS, Sigma), Developer(부흥산업), Fixer(부흥산업), bradford solution(BioRad), cuvette(BulldoBio)
 
실험방법
1. 지방조직에서 단백질을 추출하고, Bradford assay를 이용하여 정량한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13094. 단백질 정량]을 참조한다.
- 지방조직의 단백질 추출시, 간조직보다 많은 양이 필요하다. (단백질량이 적음)
2. 단백질 농도를 30 μg으로 맞추어 시료를 준비한다.
Tips:
- 단백질 농도는 실험조건에 맞게 조정할 수 있다.
3. Gel unit을 장치한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13101. Western blotting] 실험예를 참조한다.
4. 10% acrylamide separating gel solution(D.W. 4.3 ml, 40% acrylamide mix 3 ml, 1.5 M Tris(pH8.8) 2.5 ml, 10% SDS 10 0μl, 10% APS 100 μl, TEMED 4 μl; total volume 10 ml)을 준비한다.
Tips:
- 단백질 분자량에 맞추어 acrylamide %를 조정할 수 있다. Acrylamide 농도가 높을수록 gel의 pore size는 작아진다. C/EBPα의 분자량은 42kDa으로 10~12% acrylamide gel를 사용할 수 있다.
5. 준비한 separating solution을 유리판 사이에 주입한다. .
6. Water-saturated n-butanol을 조심스럽게 seperating gel 위에 뿌리고, 약 20~30분간 방치하여 gel을 굳힌다
Tips:
- Water-saturated n-butanol: 물과 butanol을 1:1로 섞은 후, 아래층을 버린다. 이 과정을 반복한다.
- Water-saturated n-butanol은 seperating gel 경계면을 평평하게 만들기 위함이다.
7. Water-saturated n-butanol을 버리고 D.W로 여러번 씻어준다. 물기는 3MM paper를 사용하여 제거한다.
8. 5% stacking gel solution (D.W. 3.6075 ml, 40% acrylamide mix 622.5 μl, 1.5 M Tris(pH6.8) 630 μl, 10% SDS 50 μl, 10% APS 50 μl, TEMED 5 μl; total volume 5 ml)을 준비하여 seperating gel 위에 붓고, comb를 꽂는다. 약 10~20분간 방치하여 응고시킨다.
9. Gel이 응고되면 comb를 조심스럽게 제거하고 주변 장치도 제거한다. Well 사이를 물로 씻어내고, 유리판에 묻은 gel도 제거해준다.
10. Gel이 굳어있는 유리판을 전기영동장치에 고정시킨다.
11. 유리판과 전기영동장치 사이에 running buffer를 가득 채우고, tank에도 buffer를 넣어서 백금선이 닿도록 한다.
Tips:
- running buffer-0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 1% SDS
12. 각 well에 정량한 단백질과 marker를 loading한다.
13. 전기영동한다(100 volt, 90분).
14. 전기영동이 끝난 후, gel을 장치와 유리판에서 조심스럽게 분리하여 transfer buffer에 침지시킨다.
Tips:
- transbuffer-0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 20% methanol
15. Gel를 membrane 위에 얹고 다음과 같이 장치한 후, transfer buffer를 transfer kit에 채운다.
Tips:
- Membrane은 메탄올에 미리 적셔 activation 시킨다.
- Fiber pad, filter paper는 transfer buffer에 미리 담근다.
16. Tank에 transfer buffer를 채운 뒤, 350 mA, 2시간 정도 transfer한다.
Tips:
- 온도가 올라가면 gel sandwich사이에 공기방울이 형성되어 transfer가 잘 되지 않으므로 아이스팩을 사용하여 냉각시켜 준다.
- 단백질이 제대로 transfer 되었는지 확인하기 위해, Ponceau S 용액에 2분 정도 담가두어서 붉게 염색 된 band를 확인한다. DW로 헹구어 주면 Ponceau S staining은 제거된다.
17. Transfer가 끝난 뒤 Membrane을 실온에서 2시간동안 5% skim milk/TBST로 Blocking한다.
Tips:
- skim milk대신 bovine serum albumin(BSA)를 이용하기도 한다.
- TBST: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4
18. 상온에서 TBST로 15분, 5분, 5분간 shaking하면서 washing한다.
19. Primary antibody (C/EBPα)을 TBST로 1,000배 희석한 용액에 membrane에 넣고 4℃에서 shaking하면서 overnight한다.
Tips:
- Primary antibody의 사용량은 실험적으로 결정되기 때문에, 권장사용량에 맞추어 사용하면 된다.
- 상온에서 2~4시간 shaking할 수 있다.
20. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 washing한다.
21. Secondary antibody을 TBST로 10,000배 희석한 용액에 membrane에 넣고 상온에서 2시간동안 shaking한다.
22. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 washing한다.
23. Cassette에 membrane을 넣고, ECL solution을 뿌린다.
Tips:
- Membrane를 wrap에 싸기도 사고, OHP 필름을 이용하기도 한다.
24. 암실에서 X-ray 필름에 15분간 감광시킨다.
Tips:
- 감광시간은 조건에 맞게 설정한다.
25. 카세트를 열어 필름을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 Fixer에 담근다.
26. Fixer에 담긴 필름을 물통으로 옮겨 담근 다음, 물기를 털고 건조시킨다
실험결과 예
 
결과해석
지방조직에서 C/EBPα 단백질의 발현이 고지방 식이를 공급받은 군에서 증가한 반면, 항비만 소재가 함유된 고지방식이를 공급받은 군에서는 감소한 것으로 보아 C/EBPα 단백질 발현 억제능이 있는 것으로 판단된다.
참고문헌
첨부파일
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