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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 3T3-L1 fibroblast에서 ACC 단백질 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방합성 억제
실험배경
비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형에 의해 유발되며 이 때 지방세포의 비대, 지방전구세포로부터의 분화 등이 유도된다. 지방세포의 분해 과정을 통해 유리지방산이 지방산화 (β-oxidation) 과정을 통해서 에너지로 사용되면서 섭취와 소비의 균형을 맞추게 된다. 몇몇 연구들은 AMP-activated protein kinase (AMPK)가 세포내 에너지 상태의 변화에 반응하여 대사 전환의 주된 조절자로서 탄수화물과 지방 대사에 중요한 역할을 담당하고 있음을 보여주고 있으며 제 2형 당뇨병과 비만의 원인에 관여되어 있을 가능성을 제시하고 있다. 지방조직에서의 AMPK의 활성화는 fatty acid와 stero의 합성과정에 중요한 조절 단계를 촉매하는 acetyl-CoA carboxylase (ACC)를 불활성화시킴으로써 지방분해와 지방생성을 감소시킨다. 후보 물질의 항비만 효능 평가를 위한 방법으로 후보 물질을 성숙한 지방세포에 처리하여 지방산화 과정과 관련된 유전자의 발현의 증가에 따라 항비만 효능을 갖는다고 판단한다. 
실험재료
필요장비 및 소모품
Immun-Blot PVDF Membrane, 원심분리기
 
필요시약
Ripa buffer(10X), Non-fat dry milk, Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X), ECL plus detection kit, Primary antibody ACC, p-ACC
 
세포주
3T3-L1 fibroblast (ATCC), 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방세포
 
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함하는 DMEM 배지 (증식용 배지)를 사용하여 배양한 후 플레이트에 적절한 세포수로 배양한다.
2. 10% FBS를 포함한 DMEM (분화용 배지) 플레이트에 세포가 빈틈없이 자란 후 2-3일간 더 배양한다.
3. 세포를 분화 유도 물질인 insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)을 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양한다.
4. 세포를 insulin (5 μg/mL)만 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양 후 10% FBS/DMEM 로 교환한 후 세포내에 지방이 축적되는 시점까지 6-8일간 더 배양한다.
5. 세포들을 얼음물 온도로 냉각된 PBS로 두 번 세척한 뒤, scrapper로 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Nonidet-p40, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS, 1 mM Na3VO4, 10 μg/ml leupeptin, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride로 구성)으로 얻은 후 얼음에서 냉각되어 1시간 동안 lysis 한다.
6. 원심분리기로 18,000 g로 4 ℃조건에서 20분간 원심분리한 후, 상청액의 단백질 양을 정량한 후 30 μg의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel로 전기영동하여 분리하고 poly vinylidene difluoride 막으로 transfer(이동) 시킨다.
7. 막을 TBST(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.06% Tween-20)에 용해된 5% (w/v) 건조 skim mik(건조 무지방 우유)로 30분간 block한 후 5 % (w/v) 무지방 건조 우유를 포함하는 TBST에서 1시간동안 AMPK, p-AMPK, ACC, p-ACC 일차 항체와 배양한다.
8. blot들을 2.5% (w/v) 무지방 건조 우유를 포함하는 TBST에서 30 분간 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체로 처리한다.
9. ECL plus detection kit로 immune complex(면역반응이 일어난 복합체)를 측정한다.
결과해석
후보 물질에 의해 ACC 비활성화는 각각의 단백질을 인산화 시키며 지방세포의 β-산화를 이끌게 된다. 후보 물질에 의해 p-ACC 가 되면 β-산화가 증가되어서 항비만 효능을 갖는다고 판단한다.
참고문헌 1. 장미, 김연주, 민진우, 양덕춘, 산수유로부터 gallic acid 추출 및 HPLC에 의한 정량분석, 한국식품과학회지, 41(5) p498-502, 2009
2. 이상국, 한진수, 박용준, 강선주, 김정선, 남기열, 이기택, 최재을, 홍삼 물 추출액의 사포닌 함량 및 맛의 증진을 위한 추출 조건, 한국작물학회지, 54(3) p287-293, 2009
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제목 3T3-L1 fibroblast에서 ACC 단백질 발현 측정 링크 지방합성 억제
실험재료
필요장비 및 소모품
Immu-Blot PVDF Membrane (162-0175, Bio-Rad), Centrifuge
 
필요시약
Ripa buffer(10X), Non-fat dry milk, Tris Buffered Saline with Tween 20(TBST-10X), ECL plus detection kit, ACC antibody (3662, Cell Signaling), p-ACC antibody (3661, Cell Signaling)
 
실험방법
1. 세포 배양- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
Tips :
- 세포가 well에 가득 차지 않은 상태에서 분화를 유도하면 분화가 잘 안됨!
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
Tips :
- 계대수가 높은 세포를 사용할 경우, well 가장자리의 세포가 박리되어 떨어질 수 있음.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 세포내에 지방이 축적되는 시점까지 6-9일간 더 배양한다.
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포
1) High calorie high fat diet(60% fat)로 비만을 유도한 수컷 SD rat을 경추탈골 시킨다.
2) 경추탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 μM filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm에서 5분간 centrifuge한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한방울 (10 ㎕)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10) 6 well plat에 5×104 cells/well로 seeding 한다.
 
3. Western blot 을 이용한 ACC 발현 시험법
1) 세포들을 얼음물 온도로 냉각된 PBS로 두 번 세척한 뒤, Plate를 얼음 위에 올려놓은 뒤 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) Nonidet-p40, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS, 1 mM Na3VO4, 10 ug/ml leupeptin, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride로 구성)을 6 well plate의 1 well당 200 μl씩 넣는다.
2) Scrapper를 이용하여 세포가 떨어지도록 긁어준 후 EP-tube에 담아 얼음물 상태에서 30분 동안 sonication해준다.
Tips:
- Sonication을 실시하는 동안 10분 마다 강한 vortex를 해주어야 많은 양의 protein이 추출된다.
3) 원심분리기로 18,000 g로 4℃조건에서 20분간 원심분리한 후, 상청액을 ep-tube에 담아 단백정량을 한 후 모든 시료의 단백량을 동일하게 lysis buffer를 이용하여 맞춰준 후 실험 전까지 -80℃에 보관해둔다.
4) 실험하기 위해 -80℃에 보관해 두었던 시료를 얼음에  놓고 녹인다. 4X sample buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 40% glycerol, 8% SDS, 4% β-mercaptoethanol, 0.2% bromophenol blue)를 sample에 함께 섞은 후 끓는 물에서 5분간 끓여 준다.
5) 30 μg의 단백질을 만들어 놓은 SDS-polyacrylamide gel (1.5 M Tris-HCl (pH 8.0), DDW, 30% acrylamide, 10% SDS, TEMED, 10% APS)에 loading한 후 10% SDS PAGE buffer (Tris base, glycine, SDS)를 이용하여 120 V에서 protein을 분리해준다.
Tips:
- stacking gel에서는 약 40분간 40 V에서 실시한다.
6) 전기영동이 끝나면 gel의 단백질을 Transfer buffer (Tris base, glycine, SDS, methyl alcohol)를 이용하여 PVDF membrane으로 옮겨준다.
Tips:
- Transfer buffer는 쉽게 뜨거워지므로 전기영동하는 동안 냉장고에 보관해 둔다. 냉동고에 보관되어 있는 얼음팩을 transfer buffer에 같이 넣어주면 buffer가 빨리 뜨거워지는 것을 방지할 수 있다. Buffer가 뜨거워지면 membrane이 타므로 주의해야 한다.
7) Transfer된 membrane을 납작한 통에 옮겨 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.06% Tween-20)에 용해된 5% (w/v) 건조 skim mik(건조 무지방 우유)에 용해된 5% skim milk를 부어 상온에서 1시간동안 Orbital shaker을 이용한 shaking상태에서 blocking을 실시한다.
Tips:
- blocking은 냉장에서 over night해도 무방하다.
8) Blocking이 끝나면 skim milk를 버리고 membrane에 남아있는 skim milk는 TBST로 한두 번 살짝 세척해준다.
Tips:
- 과도한 세척은 blocking 효과를 제거하게 되므로 납작한 통을 두 세 번씩 흔들기를 2번 실시해 준다.
9) ACC, p-ACC의 1차 항체를 5% BSA에 희석한다.
Tips:
- Antibody 희석배수는 information sheet에 나와 있으며 일반적으로는 1:1000을 해주는 것이 보통이다.
10) 희석한 1차 항체를 납작한 통에 membrane이 잠길 정도로 부어준 후 냉장상태에서 overnight shaking해 준 후 PBS를 이용하여 5분씩 1시간 동안 세척해준다.
11) ACC, p-ACC의 1차 항체와 동일한 Host의 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체를 5% skim milk에 희석한 후 희석한 2차 항체를 membrane이 잠길 정도로 부어준 후 상온에서 1~2시간 shaking해 준다.
Tips:
- 1:10000 희석배수에서도 아주 잘 붙으며 붙지 않을 경우 희석배수를 더 높여 주어도 무방하다.
12) PBS를 이용하여 10분 간격으로 3번 washing하여 1시간 동안 세척해준다.
13) ECL plus detection kit로 immune complex(면역반응이 일어난 복합체)를 측정한다. 
실험결과 예
출처 : Bustos M et al., 2009
결과해석 ACC의 비발현 수준은 시료처리에 따라서 차이가 없었으나 ACC의 인산화된 형태인 p-ACC의 발현이 농도 의존적으로 증가되는 것으로 보아 후보 물질이 β-산화 활성화 효능이 있는 것을 알 수 있다. 
참고문헌 1. Murase T, Misawa K, Haramizu S, Hase T, Catechin-induced activation of the LKB1/AMP-activated protein kinase pathway, Biochem. Pharmacol., 78(1) p78-84, 2009
2. Lorente-Cebrián S, Bustos M, Marti A, Martinez JA, Moreno-Aliaga MJ, Eicosapentaeonic acid stimulates AMP-activated protein kinase and increases visfatin secretion in cultured murine adipocytes, Clin. Sci., 117(6) p243-249, 2009
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