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기능/지표 성분기능/지표 성분 입니다

기능/지표 성분 분석법

기능/지표 성분 분석법 상세페이지
구분 지방산 및 지질류 성분명 아스타잔틴
개요 본 시험법은 시료를 아세톤으로 녹여 추출하고 cholesterolesterase를 넣어 아스타잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시킨 후 정제하여 아세톤으로 녹인 용액을 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 474nm에서 검출하여 정량분석 한다.
장비 및 재료 [ 실험실 장비 및 소모품 ]
부피플라스크(200 mL, 100 mL)
액체크로마토그래프용 유리병
용매용 일회용 실린지
여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터
원심분리기
10 mL 원심분리관
초음파진탕기
항온수조
감압농축기
   
[ 분석장비 ]
자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)
고속액체크로마토그래프
자외부흡광광도검출기
YMC Carotenoid 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250mm) 또는 이와 동등한 것
      
[ 분석장비의 준비 ]
이동상인 메탄올, MTBE, 1% 인산용액(81:15:4)을 분당 1.0 mL씩   충분한 시간동안 흘려 기기를 안정화 시킨다.
표준물질 및
일반시약

[ 표준물질 ]
1. 아스타잔틴(Astaxanthin)
- 3,3’-Dihydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione
- 분자식 : C40H52O4, 분자량 : 596.84, CAS No. : 472-61-7

 

                             
[ 일반시약 ]
1. 헥산(Hexane)
2. 아세톤(Acetone)
3. 석유 에테르(petroleum ether)
4. 메탄올(Methanol)
5. MTBE(t-buthylmethylether)
6. 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)
7. 황산나트륨(Sodium sulfate decahydrate)
8. Cholesterolesterase(22unit/mg)
9. 인산용액(Phosphoric acid)
10. 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous)
방법 [ Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제) ]
1. Cholesterol esterase가 4 unit/mL이 되도록 50 mM Tris-HCL 완충액(pH7.0)에 용해 시킨다.
 
[ 내부표준용액의 조제 ]
1. 내부표준용액(trans-β-apo-8’-Carotenal) 1 mg/mL 농도의 용액 7.5 mL을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.
2. 아세톤 100 mL을 첨가하여 완전히 용해시킨 후 방냉한다.
3. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
    
[ 표준원액의 조제 ]
1. 아스타잔틴 표준품 5 mg을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.
2. 100 mL의 아세톤을 넣고 10분간 초음파 처리하여 용해 후 방냉한다.
3. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
     
[ 표준용액 농도산출을 위한 시험 ]
1. 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.
2. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
3. 4.4.2용액을 아세톤을 대조액으로 하여 474nm에서 흡광도를 측정한다.
    
[ HPLC 측정을 위한 표준용액 조제 ]
1. 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.
2. 내부표준용액 10 mL을 넣는다.
3. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
      
[ 시험용액의 조제 ]
1. 시료를 60~70 ℃ 수욕 상에서 가온하여 시료를 용해시킨다.
   (시료가 응고되어 있거나 침전물 발생시)
2. 용해된 시료(아스타잔틴으로서) 약 50 mg을 100 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.
3. 아세톤 50 mL을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다
4. 위의 용액을 아세톤으로 10배 희석한 것을 시험용액으로 한다.
5. 10 mL 원심분리관에 시험용액 3 mL 내부표준용액 1 mL, Cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣는다.
6. 37 ℃ 수욕상에서 5~15분마다 흔들어주면서 45분간 반응시킨다.
7. 효소 분해 후 황산나트륨 1 g과 석유 에테르 2 mL을 첨가한다.
8. 위 용액을 30초간 혼합 후 2,000 G로 3분간 원심 분리한다.
9. 석유에테르층을 취한 것에 황산나트륨 1 g을 넣어 탈수한다.
10. 탈수된 석유 에테르층을 감압 농축하여 건조 후 아세톤 3 mL을 넣어 초음파 처리하여 용해시킨다.
11. 위 용액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
결과분석 및
계산
[ Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제) ]
1. Cholesterol esterase가 4 unit/mL이 되도록 50 mM Tris-HCL 완충액(pH7.0)에 용해 시킨다.
 
[ 내부표준용액의 조제 ]
1. 내부표준용액(trans-β-apo-8’-Carotenal) 1 mg/mL 농도의 용액 7.5 mL을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.
2. 아세톤 100 mL을 첨가하여 완전히 용해시킨 후 방냉한다.
3. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
    
[ 표준원액의 조제 ]
1. 아스타잔틴 표준품 5 mg을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.
2. 100 mL의 아세톤을 넣고 10분간 초음파 처리하여 용해 후 방냉한다.
3. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
     
[ 표준용액 농도산출을 위한 시험 ]
1. 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.
2. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
3. 4.4.2용액을 아세톤을 대조액으로 하여 474nm에서 흡광도를 측정한다.
    
[ HPLC 측정을 위한 표준용액 조제 ]
1. 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.
2. 내부표준용액 10 mL을 넣는다.
3. 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.
      
[ 시험용액의 조제 ]
1. 시료를 60~70 ℃ 수욕 상에서 가온하여 시료를 용해시킨다.
   (시료가 응고되어 있거나 침전물 발생시)
2. 용해된 시료(아스타잔틴으로서) 약 50 mg을 100 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.
3. 아세톤 50 mL을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다
4. 위의 용액을 아세톤으로 10배 희석한 것을 시험용액으로 한다.
5. 10 mL 원심분리관에 시험용액 3 mL 내부표준용액 1 mL, Cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣는다.
6. 37 ℃ 수욕상에서 5~15분마다 흔들어주면서 45분간 반응시킨다.
7. 효소 분해 후 황산나트륨 1 g과 석유 에테르 2 mL을 첨가한다.
8. 위 용액을 30초간 혼합 후 2,000 G로 3분간 원심 분리한다.
9. 석유에테르층을 취한 것에 황산나트륨 1 g을 넣어 탈수한다.
10. 탈수된 석유 에테르층을 감압 농축하여 건조 후 아세톤 3 mL을 넣어 초음파 처리하여 용해시킨다.
11. 위 용액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
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