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기능/지표 성분기능/지표 성분 입니다

기능/지표 성분 분석법

기능/지표 성분 분석법 상세페이지
구분 비타민 성분명 비오틴(제2법)
개요 본 시험법은 시료 중 존재하는 비오틴을 준비된 배지에 가한 후 균을 접종하여 배양 후 탁도법에 의한 증식도를 측정한 후, 공시험을 투과도 100%로 하여 분광광도계에서 540~610 nm의 파장으로 흡광도를 구하여 탁도 측정에 의해 정량한다.
장비 및 재료
[ 실험실 장비 및 소모품 ]
항온기
건조기
멸균기
무균대
시험관(10~15mL)
피펫
삼각플라스크(50mL)
   
[ 분석장비 ]
분광광도계
표준물질 및
일반시약
[ 표준물질 ]
1. Biotin
- 분자식 : C10H16N2O4S, 분자량 : 244.31, CAS No. : 58-85-5

  
[ 일반시약 ]
1. 에탄올(Ethanol)
2. 염산(Hydrochloric acid)
3. 증류수(Distilled water)
4. 초산(Acetic acid)
5. 수산화나트륨(Sodium chloride)
방법
* 일반정량조작법 *
[ 시험균의 보존 ]
1. 유산균류는 고층한천배지에 보존하며, 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 한다.
2. 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5% 조성으로 한다.
3. 위의 배지에 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8~7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10 mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다.
4. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.
[ 접종균액 ]
1. 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다.
2. 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배양한다.
3. 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.
[ 기초배지 ]
1. 염류용액 A
1.1. KH2PO4와 K2HPO4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.
2. 염류용액 B
2.1. MgSO4․7H2O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO4․7H2O 0.1 g 및 MnSO4․4H2O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.
3. 카제인 산분해용액
3.1.비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정한다.
3.2.5배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8~12시간 가열한다
3.3.점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 mL를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다.

* 비오틴 정량조작법 *
[ 시액 및 표준용액의 조제 ]
1. 비오틴 보존용액
1.1. 비오틴 표준물질을 50% 에탄올에 녹여, 그 1 mL에 비오틴 20 μg이 함유되도록 한다. 이 용액은 냉소에 보관한다.
2. 비오틴 표준용액
2.1. 사용 시 비오틴 보존액을 물로 희석하여, 그 1 mL에 비오틴 0.2 μg이 함유되도록 한다.
3. 카제인 산분해용액
3.1. 판토텐산(제1법) 중 시험과정의 일반정량 조작법 아데닌-구아닌-우라실용액 정량용기초배지에 따른다.
4. 아데닌-구아닌-우라실용액
4.1.아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 mL로 가열하면서 녹인다.
4.2.식힌 후 물을 가하여 100 mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.
5. 시스틴 트립토판 용액
5.1. L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 350~400 mL의 물로 희석하여 70~80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다.
5.2.식힌 후 물을 가해서 전량을 500 mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.
6. 비타민 B1․비타민 B2 용액
6.1.비타민 B1염산염, 비타민 B2를 0.02 N 초산에 녹여, 그 1 mL가 비타민 B1염산염 10 μg 및 비타민 B2 20 μg을 함유하도록 한다. 이 용액은 톨루엔을 소량 가하여, 빛을 차광하여 냉소에 보관한다.
7. p-아미노안식향산․니코틴산․판토텐산칼슘․비타민 B6 용액
7.1. 용액 1 mL가 p-아미노안식향산 10 μg, 니코틴산 20 μg, 판토텐산 칼슘 20 μg, 피리독신염산염 40 μg을 함유하도록 25% 에탄올에 녹인다. 이 용액은 냉소에 보관한다.
8. 염류용액 A 및 B
8.1. 판토텐산(제1법) 중 시험과정의 일반정량 조작법에서 아데닌-구아닌-우라실용액 정량용기초배지에 따른다.
[ 기초배지의 제조 ]
1. 카제인 산분해용액 10 mL, 시스틴-트립토판용액 20 mL, 아스파라긴용액 3 mL, 아데닌-구아닌-우라실용액 1 mL, 크산틴용액 2 mL, 비타민용액 20 mL, 염류용액 B 2 mL, MnSO4 용액 2 mL 및 폴리솔베이트 80 용액 0.1 mL를 잘 섞고바릴티로신 표준물질 6mg을 정밀히 측정한다.
2. 포도당 4 g, 인산이칼륨(K2HPO4) 0.64 g 및 구연산나트륨(C6H5O7Na3․2H2O) 5.2 g을 가하여 녹인다.
3. 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100 mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.
4. Folic acid assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.
  
[ 접종균액의 제조 ]
1. Lactobacillus plantarum 보존균주
1.1.효모엑기스 0.5 g, 펩톤 1 g, 포도당 1 g 및 초산나트륨(3H2O) 1 g을 물 60~70 mL에 녹여, 1~2분 끓인다.
1.2. 냉각 후, 염류용액 A 및 B 각 0.5 mL를 가하고 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정한다.
1.3. 물을 가하여 100 mL로 하고, 이것에 분말한천 2 g을 녹여, 10~15 mL씩 시험관에 분주하여 1 kg/cm2로 15분간 가압 멸균하여, 시험관을 수직으로 보존하여 방냉한다.
1.4. Lactobacillus plantarum ATCC No. 8014의 순수배양에서 상기의 균주보존용 배지에 균을 접종하고, 37℃에서 16~24시간 배양하여, 냉소에 저장하여, 1주간마다 이식한다.
2. 접종용배지
2.1. Lactobacillus plantarum 보존균주의 균주보존용배지의 조제법에 따라서, 최후에 분말한천을 가하지 않고 불용잔사를 여과하여 없애고 5 mL씩 시험관에 분주하고 1 kg/cm2 15분간 가압멸균하여 방냉하여 접종용 배지로 한다.
3. 접종균액
3.1. Lactobacillus plantarum의 보존균주를 접종용 배지에 이식한다.
3.2. 37℃에서 16~24시간 배양하고, 증식한 균액을 무균적으로 원심분리 한다.
3.3. 상등액을 비스듬하게 하여 제거하고, 여기에 멸균생리식염수 약 5 mL로 현탁시켜 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이 조작을 2회 반복하여 균을 세정한다.
3.4. 세정이 끝난 균액을 멸균생리식염수로 10~100배로 희석하여 접종균액으로 한다.
 
[ 시험용액 제조 ]
1. 비오틴 약 200 μg을 함유하는 시료를 50 mL의 삼각플라스크에 취하고 6 N 황산용액 25 mL를 가하여 1 kg/cm2로 1시간 가압한다.
2. 냉각 후, 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정한다.
3. 원심분리 또는 여과한 후 물을 가하여 용액 1 mL 중에 비오틴 약 0.2 μg을 함유하도록 희석한다.
결과분석 및
계산
* 일반정량조작법 *
[ 시험균의 보존 ]
1. 유산균류는 고층한천배지에 보존하며, 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 한다.
2. 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5% 조성으로 한다.
3. 위의 배지에 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8~7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10 mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다.
4. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.
[ 접종균액 ]
1. 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다.
2. 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배양한다.
3. 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.
[ 기초배지 ]
1. 염류용액 A
1.1. KH2PO4와 K2HPO4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.
2. 염류용액 B
2.1. MgSO4․7H2O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO4․7H2O 0.1 g 및 MnSO4․4H2O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.
3. 카제인 산분해용액
3.1.비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정한다.
3.2.5배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8~12시간 가열한다
3.3.점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 mL를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다.

* 비오틴 정량조작법 *
[ 시액 및 표준용액의 조제 ]
1. 비오틴 보존용액
1.1. 비오틴 표준물질을 50% 에탄올에 녹여, 그 1 mL에 비오틴 20 μg이 함유되도록 한다. 이 용액은 냉소에 보관한다.
2. 비오틴 표준용액
2.1. 사용 시 비오틴 보존액을 물로 희석하여, 그 1 mL에 비오틴 0.2 μg이 함유되도록 한다.
3. 카제인 산분해용액
3.1. 판토텐산(제1법) 중 시험과정의 일반정량 조작법 아데닌-구아닌-우라실용액 정량용기초배지에 따른다.
4. 아데닌-구아닌-우라실용액
4.1.아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 mL로 가열하면서 녹인다.
4.2.식힌 후 물을 가하여 100 mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.
5. 시스틴 트립토판 용액
5.1. L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 350~400 mL의 물로 희석하여 70~80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다.
5.2.식힌 후 물을 가해서 전량을 500 mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.
6. 비타민 B1․비타민 B2 용액
6.1.비타민 B1염산염, 비타민 B2를 0.02 N 초산에 녹여, 그 1 mL가 비타민 B1염산염 10 μg 및 비타민 B2 20 μg을 함유하도록 한다. 이 용액은 톨루엔을 소량 가하여, 빛을 차광하여 냉소에 보관한다.
7. p-아미노안식향산․니코틴산․판토텐산칼슘․비타민 B6 용액
7.1. 용액 1 mL가 p-아미노안식향산 10 μg, 니코틴산 20 μg, 판토텐산 칼슘 20 μg, 피리독신염산염 40 μg을 함유하도록 25% 에탄올에 녹인다. 이 용액은 냉소에 보관한다.
8. 염류용액 A 및 B
8.1. 판토텐산(제1법) 중 시험과정의 일반정량 조작법에서 아데닌-구아닌-우라실용액 정량용기초배지에 따른다.
[ 기초배지의 제조 ]
1. 카제인 산분해용액 10 mL, 시스틴-트립토판용액 20 mL, 아스파라긴용액 3 mL, 아데닌-구아닌-우라실용액 1 mL, 크산틴용액 2 mL, 비타민용액 20 mL, 염류용액 B 2 mL, MnSO4 용액 2 mL 및 폴리솔베이트 80 용액 0.1 mL를 잘 섞고바릴티로신 표준물질 6mg을 정밀히 측정한다.
2. 포도당 4 g, 인산이칼륨(K2HPO4) 0.64 g 및 구연산나트륨(C6H5O7Na3․2H2O) 5.2 g을 가하여 녹인다.
3. 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100 mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.
4. Folic acid assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.
  
[ 접종균액의 제조 ]
1. Lactobacillus plantarum 보존균주
1.1.효모엑기스 0.5 g, 펩톤 1 g, 포도당 1 g 및 초산나트륨(3H2O) 1 g을 물 60~70 mL에 녹여, 1~2분 끓인다.
1.2. 냉각 후, 염류용액 A 및 B 각 0.5 mL를 가하고 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정한다.
1.3. 물을 가하여 100 mL로 하고, 이것에 분말한천 2 g을 녹여, 10~15 mL씩 시험관에 분주하여 1 kg/cm2로 15분간 가압 멸균하여, 시험관을 수직으로 보존하여 방냉한다.
1.4. Lactobacillus plantarum ATCC No. 8014의 순수배양에서 상기의 균주보존용 배지에 균을 접종하고, 37℃에서 16~24시간 배양하여, 냉소에 저장하여, 1주간마다 이식한다.
2. 접종용배지
2.1. Lactobacillus plantarum 보존균주의 균주보존용배지의 조제법에 따라서, 최후에 분말한천을 가하지 않고 불용잔사를 여과하여 없애고 5 mL씩 시험관에 분주하고 1 kg/cm2 15분간 가압멸균하여 방냉하여 접종용 배지로 한다.
3. 접종균액
3.1. Lactobacillus plantarum의 보존균주를 접종용 배지에 이식한다.
3.2. 37℃에서 16~24시간 배양하고, 증식한 균액을 무균적으로 원심분리 한다.
3.3. 상등액을 비스듬하게 하여 제거하고, 여기에 멸균생리식염수 약 5 mL로 현탁시켜 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이 조작을 2회 반복하여 균을 세정한다.
3.4. 세정이 끝난 균액을 멸균생리식염수로 10~100배로 희석하여 접종균액으로 한다.
 
[ 시험용액 제조 ]
1. 비오틴 약 200 μg을 함유하는 시료를 50 mL의 삼각플라스크에 취하고 6 N 황산용액 25 mL를 가하여 1 kg/cm2로 1시간 가압한다.
2. 냉각 후, 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정한다.
3. 원심분리 또는 여과한 후 물을 가하여 용액 1 mL 중에 비오틴 약 0.2 μg을 함유하도록 희석한다.
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