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기능/지표 성분

분석법검증

분석법검증(method validation)의 목적은 선정된 분석시험법이 재현성이 있고 의도한 목적에 부합되는 신뢰성이 있는 결과를 얻는다는 것을 증명하는 것으로, 분석에 사용되는 시험법의 오차가 허용되는 정도를 과학적으로 입증하는 것이다. 따라서 건강기능식품으로 인정받고자 할 때, 원료선정에서부터 제품완성에 이르기까지 제조 전과정에서의 품질변화요인(원료의 표준화, 제조공정과정, 제조관리 및 품질관리 등)을 재현성 및 신뢰성을 바탕으로 과학적인 검증을 입증하여 문서화 하는 작업인 분석법 검증이 필요하다.

>> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

  • 특이성 (Specificity)
    불순물, 분해물, 배합성분 등의 혼재 상태에서 분석대상 물질을 선택적으로 정확 측정할 수
    있는 능력을 말하며, 분석방법 특성상 특이성이 부족할 경우 다른 보조적인 분석법으로 보완할 수 있다.

    특이성을 입증하기 위한 방법은 분석법이 적용되는 목적에 따라 다르며,
    특이성이 낮은 시험방법인 경우에는 2개 이상의 분석법을 추가하여 입증하여야 한다.
    - 분리한계(critical separation) - 분리도(resolution)
    - 스펙트럼(spectrum/PDA(photo diode array)
    - 질량분석(MS)
    - 유도체화를 통한 동일 물질 확인
  • 직선성 (Linearity)
    실험방법이 일정 범위에 있는 검체 중 분석대상물질의 양(또는 농도)에 대하여 직선적인 측정값을
    얻어낼 수 있는 능력을 말한다. 표준원액을 희석하여 기능성 원료 중 기능/지표물질의 각 농도에 대해서
    직접적으로 직선성을 증명하거나 시료를 중량별로 분리하여 직선성을 증명할 수 있다.
    또한 기능성 원료의 범위(range)를 검토 시 평가될 수도 있다.

    분석대상물질의 농도 또는 함량에 대한 시그널(Area/Height)의 반응으로 함수를 작성하여 직선성을 평가한다. 일차함수 및 지수함수를 이용하여 최소 5 농도값을 이용하여 검량선을 작성하며, 그렇지 않는 경우 그 방법의 타당성에 대한 근거를 제시하여야 한다. 그리고 직선성 검사를 위해 일반적인 stock solution으로부터 희석을 통해 개개의 용액들을 만드는데 이는 작은 양(mg)에서 생길 수 있는 오차를 줄여주며, 몇 일 또는 몇 주 후에 반복실험을 할 때 stock solution과 처음 희석 용액의 안정성을 확인한다. 상관계수(R2,correlation coefficient), y-절편, 회귀직선의 기울기를 첨부자료에 기재하며, 데이터에 대한 플롯도 첨부자료로 제출한다. 일차함수의 경우 상관계수가 1에 가까울수록 직선성을 가진다고 판정하며, 0.999이상을 권장한다. 분석법에 따라 직선성이 나타나지 않는 경우 검체중의 분석대상물질의 농도(또는 함량)에 대하여 적절한 함수로 표현한다.

    글리시리진(glycyrrhizin)의 검량곡선

    >> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

    <글리시리진(glycyrrhizin)의 검량곡선>
    (참고자료: 플랫폼 원료표준화 라이브러리 중 후보기능성분의 글리시리진(glycyrrhizin)_HPLC 분석법 중)

  • 정밀성 (Precision)
    균일한 시료로부터 여러 번 채취하여 시험했을 때 시험 결과 간 근접성(반산정도)를 말한다.
    반복정밀성(병행정밀성, repeatability, intra-assay precision),
    실험실 내 정밀성(intermediate precision), 실험 간 정밀성(reproducibility)

    • (1) 반복정밀성(병행정밀성, Repeatability, Intra-assay precision)

      동일한 실험실내에서 동일한 시험자가 동일한 장치, 기구, 시약 등 동일한 조건하에 균일한 검체로부터 얻은 다수의 시료를 짧은 시간차로 반복 분석하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 말한다. 반복 정밀성은 다음과 같은 방법으로 평가할 수 있다.

      • 규정된 범위를 포함한 농도에 대해 분석법의 전체 조작을 적어도 9 회 반복하여 측정 한다(예를 들면, 3 농도에 대해서 분석법의 전조작을 각 농도 3 회씩 반복 측정한다.)
      • 시험농도의 100 %에 해당하는 농도로 분석법의 전 조작을 적어도 6 회 반복 측정한다.
    • (2) 실험실내 정밀성(Intermediate precision)

      동일 실험실내에서 다른 실험일, 다른 시험자, 다른 분석장비 등을 이용하여 분석 실험하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 말한다.실험실내 정밀성의 평가범위는 분석법이 사용되는 상황에 따라 정해진다. 밸리데이션 승인을 신청하는 경우 분석법의 정밀성에 미치는 여러 가지 요인에 대한 영향을 확인할 필요가있다. 평가가 필요한 대표적인 변동요인은 실험일, 시험자, 시험장치 등이다.

    >> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

  • 정확성 (Accuracy)
    시험결과가 참값이나 표준값에 근접한 정도를 의미한다.
    이미 농도를 알고 있는 표준 용액을 검체에 넣은 후 분석에 의해 회수율로 시험법의 정확도를 측정한다.

    정확성은 시험방법이 규정하는 범위 전역에 걸쳐 입증되어야 하나 규정하는 범위를 포함하는 최소한 3농도에 대하여 시험방법의 전체 조작을 최소 9회 반복하여 측정한 결과로 평가하도록 한다(예 3농도 각 농도당 3반복). 시료 중에 공존하는 다량의 매트릭스(matrix) 는 분석대상성분의 검출을 방해하거나 회수율을 떨어뜨리기도 한다. 그러므로 가능한 시료와 유사한 조건에서 전처리과정을 거쳐 좋으며, 단순한 matrix와 표준품을 이용하여 회수율을 구하는 것은 적절하지 않을 수 있다.

    • (1) 회수율을 구하는 방법
      • - analyte-free matrix를 이용하여 표준물질을 추가하여 회수율 구함
      • - analyte-free matrix를 이용하여 분석물질의 농도를 알고 있는 시료를 추가하여 회수율을 구함. 이는 충분한 양의 표준물질 수급이 어려울 때 사용되며, 시료 중 분석물질의 함량이 높을 경우에 적용된다.
      • - 분석물질의 농도를 알고 있는 시료에 표준물질을 추가하여 분석물의 회수율을 측정함.
    • (2) 계산식
      계산식

      동일 실험실내에서 다른 실험일, 다른 시험자, 다른 분석장비 등을 이용하여 분석 실험하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 말한다.실험실내 정밀성의 평가범위는 분석법이 사용되는 상황에 따라 정해진다. 밸리데이션 승인을 신청하는 경우 분석법의 정밀성에 미치는 여러 가지 요인에 대한 영향을 확인할 필요가있다. 평가가 필요한 대표적인 변동요인은 실험일, 시험자, 시험장치 등이다.

    >> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

  • 검출한계 (Detection Limit)
    검체 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소향을 말하며, 반드시 정량 가능할 필요는 없다.

    분석법이 기기분석에 따라 검출한계와 정량한계를 구하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용 가능하다. 따라서 다음에 3가지 제시하는 방법 이외의 다른 방법을 이용할 수도 있다.

    • (1) 시각적 평가에 근거하는 방법

      검출한계에 가깝다고 생각되는, 이미 알고 있는 양의 분석대상물질을 함유하는 시료를 반복 분석하여 분석대상물질이 확실하게 검출 가능하다는 것을 확인하고 이를 검출한계로 본다. 정량한계는 분석대상물질을 함유한 검체를 분석하고 그 분석대상물질을 인정될 수 있는 정도의 정확성과 정밀성을 가지고 정량될 수 있는 분석대상물질의 최저 농도를 확인함으로써 결정된다.

    • (2) 시그널(signal) 대 노이즈(noise)에 근거하는 방법

      이 방법은 베이스라인 노이즈를 수반하는 분석법에만 적용할 수 있다. 시그널 대 노이즈 비는 시험용액의 낮은 농도 분석대상물질을 포함한 검체의 시그널과 공시험 검체의 시그널을 비교하여 구하고, 일반적으로 3~2:1의 시그널 대 노이즈비가 산출되는 분석대상물질의 최저 농도가 검출한계, 10:1의 표준적 시그널 대 노이즈 비를 확실하게 정량할 수 있는 분석 대상물질의 최저의 농도가 정량한계가 된다.

    • (3) 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법

      검출한계(DL), 정량한계(QL)는 다음 식에 의해 결정할 수 있다.
      DL = 3.3 * σ/S
      QL = 10 * σ/S
      (σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)

      기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구할 수 있다. 표준편차(σ)에 대해서는 여러 가지의 측정방법이 있고 그 예는 다음과 같다.

      공시험 검체의 표준편차에 근거하는 방법
      - 적당한 수의 공시험 검체를 분석하여 이 측정값의 표준편차를 계산함으로써 분석법의 기본(background) 반응 정도를 측정한다.
      검량선에 근거하는 방법
      - 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한다. 회귀직선에서 잔차의 표준편차(residual standard deviation) 또는 회귀직선(regression line) 에서 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용할 수 있다.

      검출한계와 정량한계와 함께 검출한계, 정량한계를 구할 때 사용한 방법을 첨부자료에 기재하여 한다. 계산(calculation) 또는 외삽(extrapolation)에 의해 검출한계를 산출하였을 경우에는 적당한 수의 검출한계 농도 혹은 그 부근 농도의 검체에 대한 분석을 실시하여 제출값의 타당성을 입증한다. 시각적 평가 또는 시그널 대 노이즈 비에 의해 검출한계를 결정할 경우에는 그 타당성을 입증할 수 있는 크로마토그램을 제출해야 한다.

      >> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

  • 정량한계 (Quantitation Limit)
    적절한 정밀성과 정확성을 가진 정량값으로 표현할 수 있는 검체 중 분석대상 물질의 최소량을 말한다.

    분석법이 기기분석에 따라 검출한계와 정량한계를 구하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용 가능하다. 따라서 다음에 3가지 제시하는 방법 이외의 다른 방법을 이용할 수도 있다.

    • (1) 시각적 평가에 근거하는 방법

      검출한계에 가깝다고 생각되는, 이미 알고 있는 양의 분석대상물질을 함유하는 시료를 반복 분석하여 분석대상물질이 확실하게 검출 가능하다는 것을 확인하고 이를 검출한계로 본다. 정량한계는 분석대상물질을 함유한 검체를 분석하고 그 분석대상물질을 인정될 수 있는 정도의 정확성과 정밀성을 가지고 정량될 수 있는 분석대상물질의 최저 농도를 확인함으로써 결정된다.

    • (2) 시그널(signal) 대 노이즈(noise)에 근거하는 방법

      이 방법은 베이스라인 노이즈를 수반하는 분석법에만 적용할 수 있다. 시그널 대 노이즈 비는 시험용액의 낮은 농도 분석대상물질을 포함한 검체의 시그널과 공시험 검체의 시그널을 비교하여 구하고, 일반적으로 3~2:1의 시그널 대 노이즈비가 산출되는 분석대상물질의 최저 농도가 검출한계, 10:1의 표준적 시그널 대 노이즈 비를 확실하게 정량할 수 있는 분석 대상물질의 최저의 농도가 정량한계가 된다.

    • (3) 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법

      검출한계(DL), 정량한계(QL)는 다음 식에 의해 결정할 수 있다.
      DL = 3.3 * σ/S
      QL = 10 * σ/S
      (σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)

    기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구할 수 있다. 표준편차(σ)에 대해서는 여러 가지의 측정방법이 있고 그 예는 다음과 같다.

    공시험 검체의 표준편차에 근거하는 방법
    - 적당한 수의 공시험 검체를 분석하여 이 측정값의 표준편차를 계산함으로써 분석법의 기본(background) 반응 정도를 측정한다.
    검량선에 근거하는 방법
    - 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한다. 회귀직선에서 잔차의 표준편차(residual standard deviation) 또는 회귀직선(regression line) 에서 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용할 수 있다.

    검출한계와 정량한계와 함께 검출한계, 정량한계를 구할 때 사용한 방법을 첨부자료에 기재하여 한다. 계산(calculation) 또는 외삽(extrapolation)에 의해 검출한계를 산출하였을 경우에는 적당한 수의 검출한계 농도 혹은 그 부근 농도의 검체에 대한 분석을 실시하여 제출값의 타당성을 입증한다. 시각적 평가 또는 시그널 대 노이즈 비에 의해 검출한계를 결정할 경우에는 그 타당성을 입증할 수 있는 크로마토그램을 제출해야 한다.

    >> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

  • 범위 (Range)
    적절한 정밀성, 정확성 및 직선성을 충분히 제시할 수 있는 검체 중 분석대상물질 양(또는 농도)의
    하한 및 상한값 사이의 영역을 말한다.

    일반적으로 범위(Range)는 직선성 평가 시 결정되고, 분석법이 적용되는 목적에 따라 달라질 수 있다. KORAS에서는 LOQ이상의 농도에서 직선성이 나타나는 농도부터 상한값을 설정 범위를 설정하며, AOAC와 ICH에서는 규정하는 범위 내 또는 그 범위의 양단의 농도를 포함한 검체를 이용하여 분석법의 직선성, 정확성 및 정밀성을 확인함으로써 범위의 타당성을 입증한다. 최소로 규정하는 범위는 검체 중 분석대상물질의 양(또는 농도)의 하한값 및 상한값 사이의 영역을 설정하며 일반적으로 시험농도의 80~120%로 설정한다.

    >> 본 내용은 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기술지원보고서’ 참고

  • 완건성 (Robustness)
    분석조건(컬럼, 추출시간 등)을 고의로 변동시켰을 때의 분석법의 신뢰성을 나타낸다.

    완건성은 분석조건을 고의로 변동시켰을 때의 분석법의 신뢰성을 나타낸다. 만약, 측정값이 분석조건 변경에 따라 영향을 받기 쉬운 경우라면, 분석조건을 적절히 조정하던지 분석법 중에 사전 조심 문구를 포함시킬 필요가 있다. 완건성을 평가함에 따라 시스템 적합성에 관한 일련의 파라미터 (예; 분리도)를 확립할 수 있다. 이러한 파라미터를 확인함으로써 일상의 분석에서 분석법의 타당성이 유지되고 있음을 보증할 수 있다. 대표적인 변동인자는 다음과 같다.

    가. 여러 가지의 분석법에 공통되는 변동 인자
    - ○ 시험용액의 안정성, ○ 추출시간
    나. 액체프로마토그래프법의 대표적인 변동인자
    - ○ 이동상의 pH, ○ 이동상의 조성(composition)의 변경, ○ 컬럼의 변경(different lots or suppliers), ○ 온도, ○ 유속
    다. 기체크로마토그래프법의 대료적인 변동인자
    - ○ 컬럼의 변경(different lots or suppliers), ○ 온도, ○ 유속

    >> 본 내용은 대한약전 중 일반정보의 「의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 지침」 참고

    또한, 생물학적 시험의 경우 샘플의 freeze-thaw stability, 세포의 계대수, 샘플의 투입순서 등도 고려의 대상

    >> 본 내용은 식품의약품안전처 발표자료 중 ‘Method Validation of Biopharmaceuticals’ 참고